HPLC法测定消炎利胆片中的穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量研究

廖志钟 欧国灯 翁雪萍

(1.广东罗浮山国药股份有限公司 广东惠州 516133； 2.广东省药品检验所 广州 510180；3.广东省惠州市药品检验所 广东惠州 516003)

消炎利胆片由穿心莲、苦木、溪黄草三味中药组成,其主要功能为清热、祛湿,利胆。用于肝胆湿热引起的口苦、胁痛;急性胆囊炎、胆管炎。穿心莲为方中主药,所含多种内酯,2000年版中国药典2003年增补本中收载了本品的质量标准,标准中只建立了脱水穿心莲内酯的含量测定方法。经研究,穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯两成份在一定条件下存在互变性,单纯选择脱水穿心莲内酯为含量测定指标不科学。本论文同时选择穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯为控制该产品质量的定量指标,采用高效液相色谱法建立其含量测定方法,该法简便、灵敏、准确,科学可行。

1 仪器与试药

岛津高效液相色谱系统(LC-10ATvp泵,SPD-M20A型二极管阵列检测器);穿心莲内酯(0797-200106)和脱水穿心莲内酯(0854-200204)对照品购自中国药品生物制品检定所;消炎利胆片10批均由广东罗浮山药业有限公司提供;甲醇为色谱纯试剂,水为超纯水,其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Dikma Technologies Diamonsil C18(250mm×4.6mm,5um)色谱柱;流动相:甲醇-水(55∶45);检测波长:穿心莲内酯为225nm、脱水穿心莲内酯为254nm;流速:1.0mL／min;进样量:10μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯对照品适量,加50%甲醇制成每1mL含穿心莲内酯0.08mg、脱水穿心莲内酯0.20mg的溶液,摇匀,即得。

2.3 供试品溶液的制备

取本品10片,除去包衣,精密称定,研细,取约0.3g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%乙醇50mL,密塞,称定重量,超声处理30min,放冷,再次称定重量,用70%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液5mL,置中性氧化铝柱(200～300目,4g,内径1.5cm)上,用70%乙醇30mL洗脱,收集洗脱液,蒸至近干,加甲醇使溶解,转移至5mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,即得。

2.4 线性关系考察

精密称取穿心莲内酯35.38mg和脱水穿心莲内酯102.16mg,分别制成每1mL分别含穿心莲内酯14.152、70.76、141.52、212.28、283.04μg及脱水穿心莲内酯40.864、204.32、408.64、612.96、817.28μg的溶液,分别吸取上述溶液各10μL注入液相色谱仪,记录色谱图,测定峰面积积分值,分别以进样浓度(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标,绘制标准曲线,得出穿心莲内酯回归方程为:Y=2147051.8X-16559(R=0.9996,n=6),穿心莲内酯在0.14152～2.8304μg范围内浓度与峰面积有良好的线性关系;脱水穿心莲内酯回归方程为:Y=1566673.6X-34074(R=0.9996,n=6),脱水穿心莲内酯在0.4 0 8 6 4～8.1 7 2 8 μ g范围内浓度与峰面积有良好的线性关系;穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯回归方程为:Y=1703326.2.8X-1388.9(R=0.9999,n=6),两成份总量在0.55016～13.754μg范围内浓度与峰面积有良好的线性关系。

2.5 精密度实验

精密吸取穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯对照品溶液l0μL,重复进样5次,测定峰面积值,穿心莲内酯RSD=0.056%,脱水穿心莲内酯RSD=0.088%,穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量总和RSD=0.14%。

2.6 重现性实验

(1)重复性试验。按拟定的含量测定方法,由同一分析员对同一样品(批号:0504051)连续测定6次,并计算含量,结果穿心莲内酯RSD(n=6)为2.0%;脱水穿心莲内酯RSD(n=6)为2.3%,穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯含量总和RSD(n=6)为1.25%。

(2)中间精密度试验。取同一批供试品(批号:L06G021),分别由A、B、C三人在不同的时间,用同一台仪器上,按含量测定方法依法测定。结果中间精密度良好。

2.7 稳定性实验

精密吸取同一供试品溶液,分别于0、2、4、8、10、12h后进样10μL,测定穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯峰面积,结果表明,供试品溶液在12h内稳定性良好。

2.8 空白试验

按照本品处方,取除穿心莲外的其余药材,按制备工艺要求,制成不含穿心莲药材的阴性样品,制成不含穿心莲药材的阴性对照溶液并测定。结果表明阴性对照在与穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯对照品色谱相应位置上无干扰。

2.9 回收率实验

精密称取已知含量的同一批供试品(批号:0 5 0 4 0 5 1;含量:穿心莲内酯9.7296mg/g,脱水穿心莲内酯31.2639mg/g)9份,分成3组,每组各3份,每份约0.15g,分别精密加入穿心莲内酯与脱水穿心莲内酯对照品适量,按供试品溶液制备方法,自“密塞,称定重量”起操作,测定。结果穿心莲内酯回收率为99.3%,RSD为1.89%;脱水穿心莲内酯回收率99.4%,RSD为2.99%,穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯总回收率为99.4%,RSD为2.19%。

3 讨论

(1)本实验经对穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯对照品溶液进行紫外全波长描述,穿心莲内酯于225nm有最大吸收,脱水穿心莲内酯于251nm有最大吸收,参考中国药典[1],本试验穿心莲内酯检测波长选择225nm,脱水穿心莲内酯检测波长选择254nm。

(2)经查找有关穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量测定文献[2～7],经试验以甲醇-水(55∶45)为流动相时,穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯峰分离度和拖尾因子等较理想,因此,本法选择甲醇-水(55∶45)为流动相。

(3)供试品溶液的制备比较了甲醇、70%乙醇、95%乙醇作为提取溶剂超声提取30min,结果显示,采用乙醇提取含量较甲醇提取含量高,以70%乙醇提取含量最高,故确定以70%乙醇为提取溶剂,超声提取30min。

(4)在纯化处理时,对比了过中性氧化铝柱和不过中性氧化铝柱,经考察,不过中性氧化铝柱时杂质干扰大,过中性氧化铝柱后杂质无干扰,峰型等符合要求,因而采用过中性氧化铝柱除杂质纯化的方法。

(5)在过中性氧化铝柱时,经用甲醇、75%乙醇及95%乙醇为洗脱剂进行洗脱,结果采用70%乙醇洗脱较完全,故选用70%乙醇为洗脱剂。

(6)在洗脱剂用量选择方面,经考察用70%乙醇20、30、40mL洗脱,结果显示,用30mL洗脱已完全,因此洗脱剂用量选择30mL溶剂即可。

(7)本文建立了高效液相色谱法测定消炎利胆片穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量,方法的重现性好,分离度好,专属性强,选择指标成份科学合理,可用于消炎利胆片的质量控制,具有可行性。

[1]中国药典2005年版一部.

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