P38丝裂原活化蛋白激酶在肝纤维化中的作用*

罗传灿 综述 张国梁 审校

肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是多种慢性肝病进展至肝硬化的中间过程，其特征为以胶原蛋白为主的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）沉积于肝脏，而肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）是HF时过量ECM的主要来源，各种致HF因素均以HSC作为最终靶细胞，激活的HSC大量增殖，转化为肌成纤维细胞，分泌过多的ECM沉积于肝脏而导致HF的发生。这一复杂的病理过程是多条细胞信号传导通路和一系列细胞信息分子网络共同控制的结果，P38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，P38 MAPK）信号传导通路是丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK）家族的重要成员，现就有关研究综述如下。

一、P38 MAPK通路在HF模型中的表达

吴文娟[1]等发现CCl4诱导的HF大鼠随着肝纤维化形成程度明显加重，P38 MAPK在mRNA水平和蛋白水平都表现出增加的趋势，并且主要表达于肝脏的间质细胞，P38 MAPK在HF的形成中持续上调，与HF程度呈显著正相关，同时实验免疫组化及RT-PCR结果显示，P-P38 MAPK在正常对照组中未见阳性表达，而P38 MAPK mRNA仅有极少量表达，说明在正常生理状态下肝组织中P38 MAPK是以无活性的非磷酸化形成存在。在HF形成中，P38 MAPK被激活，活化的P38 MAPK参与了大鼠HF形成，另外免疫组化显示P-P38 MAPK主要表达于肝间质细胞的胞核中，可见P38 MAPK信号传导通路主要作用于肝间质细胞，推测P38 MAPK信号传导通路可能通过诱导HSC的活化、增殖促进HF的形成。Reeves等[2]发现，HSC转分化中P38 MAPK作用的直接证据是其组成型活性在转分化细胞较静止型细胞为高，其抑制剂抑制了HSC活化。同时有学者也曾报道慢性肝损伤时P38 MAPK表达也增加，郭建红等[3]发现慢性肝损伤组肝组织中P-P38 MAPK与预处理组相比明显增强，提示慢性肝损与P38 MAPK的激活有关。以上研究显示P38 MAPK信号通道在慢性肝损的肝组织、HF模型中与活化HSC中均表达增强，揭示了P38 MAPK信号通道在HF的形成过程中发挥着重要的作用。

二、P38 MAPK通路与促进HF发生主要相关信号分子的关系

HSC是HF时肝脏细胞中ECM的主要来源细胞。在HF形成过程中有多种细胞因子参与，其中血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、转化生长因子 β（transforming growth factor-β，TGF-β）、白细胞介素（interleukin，IL）、瘦素（leptin，Lep）、c-Jun 氨基末端激酶（C-Jun N-terminal kinase，JNK）是重要的HSC激活细胞因子，研究发现P38 MAPK通路与它们在促HF过程中具有一定的相关性，同时受到多种因素调节，在体内形成错综复杂的作用网络。

（一）与PDGF的关系 PDGF是强大的促细胞分裂剂，是体内主要的促纤维化因子，在活化的HSC中，Lep、PDGF等细胞因子能通过Janus激酶/信号转导与转录激活子（Janus-ac-tivated kinase-signal transducer and activator of transcriptions，JAK/STAT）途径发挥作用，同时PDGF-BB还可通过细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）途径，诱导活化的HSC分泌血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），间接促进内皮细胞的生长和增殖，从而促进了HF的形成，PDGF是目前已知多肽生长因子中对HSC作用最强的有丝分裂原[4]。近年发现PDGF在促进HSC增殖时，可检测到包括P38 MAPK信号蛋白的活化[5]，因此PDGF与P38 MAPK在促进HF的研究得到重视。Adachi等[6]研究发现PDGF-BB可呈剂量依赖性促进LI-90细胞增殖，细胞数量明显增加，用Mn-TBAP（可清除细胞内的活性氧）预处理LI-90细胞30min，发现可以明显抑制PDGF-BB的促增殖效应，且有剂量依赖性。研究中观察到PDGF-BB诱导星状细胞内表达NAD（P）H氧化酶，抑制该酶则抑制了PDGF-BB的促增殖效应，表明NAD（P）H氧化酶在PDGF-BB诱导HSC增殖中的重要作用。研究者进一步分析了PDGF-BB的作用机制ERK和P38 MAPK蛋白均被活化，然而ERK抑制剂PD98059、P38 MAPK抑制剂SB203580预处理LI-90细胞1h，发现SB203580组的抑制增殖效应强于PD98059组。抑制NAD（P）H氧化酶可抑制P38 MAPK活化，但对ERK无影响，H2O2与PDGF-BB共同孵育，能抵消对P38 MAPK的抑制作用。以上研究说明PDGFBB可诱导HSC细胞NAD（P）H氧化酶的表达，并生成活性氧进而通过P38 MAPK信号通路发挥促进HSC增殖的作用。Carloni V等[6]发现PDGF与HSC上相应的受体结合后，主要通过MAPK信号通路蛋白如ERK和P38将信号传递到细胞核，促进HSC的增殖。Adachi T等[8]发现还原型辅酶Ⅱ（NADPH）氧化酶在HSC中表达，对PDGF-BB产生反应后生成活性氧族（ROS），ROS通过P38 MAPK磷酸化作用使HSC增殖。

（二）与TGF-β的关系 TGF-β是一种对细胞生长、分化和多种生理、病理过程起重要调节作用的细胞因子。TGF-β因启动、促进HSC活化而在HF形成过程中起重要作用，TGF是刺激HSC分泌ECM作用最强的细胞因子之一，在HF的发生发展过程中发挥关键作用。HSC中TGF-β信号主要通过ALKS/Smad2/3途径传递，然而近年的研究结果发现P38 MAPK在TGF-β介导的HSC效应中也发挥着重要的作用。Tsukada等[8]发现TGF-β作用HSC后，可测到P38 MAPK蛋白的表达（包含磷酸化蛋白），而用P38 MAPK的特异性阻断剂SB203580预孵育1h，则可以阻断TGF-β诱导的P38 MAPK蛋白活性。他们还发现阻断Smad信号通路并不影响基础的和TGF-β诱导的P38 MAPK活性。同样，阻断P38 MAPK也不影响Smad信号通路，说明P38 MAPK是TGFβ在HSC内可独立于Smad信号之外。同时还发现TGF-β依赖的P38 MAPK途径可以上调HSC细胞外基质的表达，如I型胶原和凝血酶敏感素-2（TSP-2）。Cao等[9]研究也显示，双亚麻油酸磷脂胆碱通过抑制氧化应激的产生及相关的H202依赖的P38 MAPK活化，阻止了TGF-β磷酸化诱导的胶原mRNA增加。Schnabl[10]也发现 TGF-β可不依赖 TGF-β/Smad2，由P38 MAPK途径直接激活Smad3，使其磷酸化，最终可导致ECM的沉积。TGF-β诱导Ⅰ型胶原基因的表达部分受P38 MAPK信号转导途径调节。研究者还发现阻断P38 MAPK或Smad均可降低培养活化的和TGF-β诱导活化的HSCα1（Ⅰ）胶原基因的表达，而同时抑制两条通路则α1（Ⅰ）胶原基因的表达几乎完全被阻断，P38既独立调节HSCα1（Ⅰ）胶原基因表达又与Smad有协同作用，研究还发现增加HSCα1（Ⅰ）胶原mRNA稳定性是由P38 MAPK介导的。曾有报道表明在培养的肌成纤维细胞中，TGF-β可先激活P38 MAPK通路，然后进一步导致Smad3交联区磷酸化，促使Smad3和Smad4异体复合物形成并移位核内，结合到PAI-1启动子促进基因的表达[11]。

（三）与IL的关系 白细胞介素（interleukin，IL）与HSC活化、增殖的相关性也是近年涉及HF研究的热点之一，不少研究表明IL-1在促进HSC活化、增殖等过程中发挥重要作用。IL-1作用于HSC后如何使之激活并增殖，信号分子在细胞内如何转导是当前学者们探究的热点问题。Zhang[12]等报道了IL-1通过对金属蛋白酶组织抑制因子-1mRNA（TIMP-1mRNA）表达的正向调节从而对HF的形成起直接作用，MAPK通路中JNK和P38在HSC的TIMP-1RNA表达中都起了重要作用。姚希贤[13]等发现IL-1β有明显促大鼠HSCⅠ型胶原合成作用，阻断P38 MAPK通路后，IL-1β的促HSCⅠ型胶原合成作用受到抑制。经不同浓度P38特异性阻断剂SB203580预处理的各组细胞，3H-脯氨酸（3H-Pro）掺入量与对照组（未用SB203580预处理）相比，其掺入量均明显降低。有学者发现IL-10在抑制HSC的过程与抑制P38的活性下降有关。李涛[14]等发现加入1ng/ml的IL-10就可以引起HSC的PDGF mRNA和蛋白表达的降低，PDGF的下游信号MAPK通路蛋白ERK和P38蛋白的表达与对照组相比显著降低，可能和1ng/ml的IL-10剂量尚不足及信号通路的级联放大作用有关。加大IL-10的剂量后HSC的PDGF及其下游信号蛋白ERK和P38蛋白的表达与对照组相比均显著降低，并呈量效依赖关系，表明激活的HSC的一个重要的特征就是大量分裂增殖，而PDGF在HSC的分裂和增殖中起了关键作用，PDGF与HSC上相应的受体结合后，激活受体羟基端的酪氨酸激酶，通过下游的MAPK蛋白如ERK和P38将信号传递到核内，促进细胞的分裂增殖。提示IL-10能通过抑制HSC激活过程中起关键作用的细胞因子PDGF及其下游信号蛋白ERK和P38的表达对HSC的激活过程产生影响。

（四）与Lep的关系 Lep是一种16U的蛋白质，主要存在于脂肪细胞中，静止的HSC很少表达Lep，在HSC活化时，Lep的合成和表达明显增加[15]，它在HF形成过程中发挥重要作用。基质金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）通过抑制胶原的降解而产生作用，由活化的HSC合成。Cao[16]研究瘦素诱导人HSC细胞系LX-2细胞表达TIMP-1的分子机制时发现，Lep可磷酸化P38 MAPK蛋白并且呈剂量和时间依赖性，Lep浓度达75μg/L时效应最明显，而在此浓度作用下2h到24h活性达峰值，约为对照组的3.6倍。进一步给予LX-2细胞JAK抑制剂AG490、过氧化氢酶、SB203580或负性P38 MAPK突变体，发现均可抑制P38 MAPK的活性，但ERK抑制剂PD098059没有此效应，说明JAK和过氧化氢参与Lep诱导的LX-2细胞内P38 MAPK途径的活化，同时发现抑制P38 MAPK通路也能抑制LX-2细胞Lep诱导的TIMP-1 mRNA的表达。认为Lep与受体结合，通过JAK途径诱发过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）产生，进而诱导H2O2依赖的P38 MAPK的活化，活化的P38 MAPK参与对LX-2细胞TIMP-1 mRNA的调节。进一步研究表明，H2O2激活ERK1/2和P38及JAK1和JAK2信号通路，抑制HSC基质金属蛋白酶-1（matrix metalloproteinases-1，MMP-1）表达，促进Ⅰ型胶原表达。有研究发现，二亚油酰磷脂酰胆碱（DLPC）或S-腺苷甲硫氨酸（SAMe）都能阻断ERK1/2和P38的磷酸化，抑制TIMP-1的表达[17]。它们还能阻止Lep或甲萘醌引起的H2O2产生，恢复消耗的谷胱苷肽，阻断H2O2介导的ERK1/2和P38，完全抑制Ⅰ型胶原mRNA的表达[18]。

（五）与JNK通路的关系 应激活化蛋白激酶，又称cjun氨基末端激酶（stress-activated protein kinase/C-Jun N-terminal kinase，SAPK/JNK）是MAPK家族的重要成员，能被多种炎性刺激因子所激活，对炎症的发生、发展起重要作用，近年发现在激活的HSC中呈高表达，而通过阻断JNK通路促进HSC凋亡[19]。张一宁等[20]在探讨胆汁酸调控肝星状细胞促进HF发生机制时发现，甘氨鹅脱氧胆酸（GCDCA）能诱导P38及JNK磷酸化的作用导致肝星状细胞增殖的作用，还能提高该细胞HSC的动能力，而JNK（SP600125）或P38（SB294002）的抑制因子能够抑制胆汁酸的这种作用。Cao[21]等报道了一种肝脏纤维蛋白溶解原细胞因子来普汀，在HSC中诱导氧化应激反应，同时增加H2O2的形成，而H2O2通过MAPK通路中P38和ERK1/2通路，激活JAK1和JAK2，刺激TIMP-1的产生，从而刺激胶原产生，HF形成。

三、P38 MAPK通路抑制HSC增殖

随着P38 MAPK通路研究的进一步深入，也有部分研究表明它在HF的形成过程中也存在负调节的作用。张亚平等[22]通过研究IL-1β上调大鼠HSCs的TIMP-1 mRNA表达与JNK和P38两条通路在激活HSC过程中的作用，发现HSCs中两条通路均可被IL-1激活，但所起作用完全不同，发现IL-1β刺激5min后，即见P38活化增强，30min时达到高峰，2h后则基本恢复初始水平，进一步研究发现阻断JNK通路可抑制HSCs TIMP-1 mRNA的表达，而阻断P38通路却可提高HSCs TIMP-1 mRNA的表达，实验结果揭示IL-1β可同时激活HSCs中JNK和P38两条通路，尽管它们所起作用完全不同，但可相互作用共同调控TIMP-1 mRNA的表达，但JNK和P38通路相互作用的结果表现为上调TIMP-1 mRNA的表达。Schnabl[10]通过研究阻断TAK1/JNK和P38 MAPK信号通路后对HSC的影响，发现阻断P38 MAPK可减少α1（Ⅰ）型胶原mRNA的表达，但促进HSC的增殖，而阻断TAK1/JNK则起相反的作用，由此可以看出活化的P38 MAPK信号通路有抑制HSC增殖、增加胶原生成的功能。王聪等[23]在研究硫化氢在大鼠肝星状细胞氧应激中的作用时，通过铁超载促进HSC增殖复制肝纤维化模型发现激活的HSC中H2S含量减少、P38表达下调。给予外源性硫化氢供体硫氢化钠能后细胞增殖减慢，使P38表达上调，缓解HSC增殖。给予内源性H2S作用的KATP通道阻滞剂GLBN（格列苯脲）后H2S含量进一步下降，P38表达进一步下调，HSC增殖加剧，从而发现氧应激下H2S通过P38基因表达水平的调控对HSC细胞产生保护作用，可抑制肝纤维化的发生发展。

四、小结

P38 MAPK信号通路参与了对HSC的活化增殖、合成胶原的调节，与 PDGF、TGF-β、IL、Lep、JNK 等多种细胞因子共同参与促进HSC激活、增殖、并合成、分泌细胞外ECM等多种物质，使ECM合成与降解失衡，在肝脏内过度沉积，肝脏结构改变，导致HF，但有部分研究表明其在对HSC起负调节作用，可见HSC的激活、增殖是一个有多种细胞因子、多种细胞信号转导通路参与的复杂的病理生理过程，P38 MAPK可能与细胞内其他的信号通路产生交叉，使作用机制更趋复杂，而多项研究表明P38 MAPK是其中极其重要组成部分。针对P38 MAPK信号传导通路的研究不仅有助于更深入地探讨HF发病的分子机制，为HF的防治研究提供更多积极有效的干预措施与方法。

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