栉孔扇贝DAPI带型和PI带型研究

徐 俊,包振民,任晓亮,王 珊,胡丽萍,黄晓婷＊＊

(1.中国海洋大学海洋生物遗传育种教育部重点实验室,山东青岛266003;2.上海市医药学校,上海200135)

栉孔扇贝DAPI带型和PI带型研究

徐 俊1,2,包振民1,任晓亮1,王 珊1,胡丽萍1,黄晓婷1＊＊

(1.中国海洋大学海洋生物遗传育种教育部重点实验室,山东青岛266003;2.上海市医药学校,上海200135)

选取栉孔扇贝Chlamys f arreri担轮幼虫为材料,采用秋水仙素-低渗-空气干燥法制备染色体标本,应用荧光显带技术,分析了DAPI带和PI带在栉孔扇贝染色体上的分布。DAPI带型结果显示,栉孔扇贝所有染色体上都存在DAPI阳性带,主要分布于传统的着丝粒区和端部区域,另外还存在一些中间区DAPI带及可变带,总带数为62。PI带型结果与DAPI带型结果相似,在所有染色体上都存在PI阳性带。2种带型的阳性带所在位置与异染色质分布区域相吻合。

栉孔扇贝(Chlamys f arreri);染色体;DAPI带;PI带

栉孔扇贝Chlamys f arreri(Jones et Preston, 1904)隶属于软体动物门Mollusca双壳纲Bivalvia翼形亚纲Pterimorphia珍珠贝目Pterioida扇贝科Pectinidae。自然分布于我国辽宁和山东沿海,朝鲜和日本沿海[1],是我国重要的海水养殖贝类。

栉孔扇贝染色体核型分析结果表明,其染色体长度基本呈连续性分布,除3对典型的中部着丝粒染色体外,其余均为亚中部和亚端部着丝粒染色体[2],单纯从形态上不易进行染色体的准确区分与配对。带型是对染色体形态结构进行精细分析的研究,有了显带技术,不仅能更准确地进行同源染色体的配对和核型排列[3],而且能精确的辨认染色体的结构变化,并能正确的识别特定的染色体以及追溯标记性染色体或超数染色体的来源,探讨生物种属染色体的进化与分化等问题,提供更多的具有鉴定性特征的信息。关于贝类染色体带型的报道,国内外文献均不太多,这很大程度上与贝类缺乏细胞培养体系,难以得到高质量的染色体标本有关,以往的报道主要集中在牡蛎、贻贝、扇贝等几种主要的经济贝类,主要开展过G带、C带、Ag-NOR带的研究,如:太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)的G带和Ag-NOR带[4];紫贻贝(Mytilus edulis)的G带、C带、Ag-NOR带和限制性内切酶带[5],贻贝M. edulis,M.galloprovincialis和M.trossulus的C带、Ag-NOR带[6];栉孔扇贝(C.f arreri)的Ag-NOR带[2],海湾扇贝(A rgopecten irradians)的C带和Ag-NOR带[7]等等。荧光染料DAPI可揭示染色体上A T富含的区域,生物细胞分裂期的前、中期的染色体相对较长,经DAPI等染料染色后染色体上会显示明显不同的深染区和浅染区[8],深染区和浅染区的大小和分布在不同染色体上互有差别,这可以作为识别特定染色体的重要标志,也可避免识别同源染色体的麻烦[9]。迄今为止,它已被广泛应用于动植物的染色体研究。

本研究利用2种荧光染料DAPI和PI,对栉孔扇贝染色体进行带型分析,构建栉孔扇贝染色体带型模式图,研究结果将丰富扇贝细胞遗传学信息,为扇贝的遗传育种及系统演化等研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

栉孔扇贝亲本取自荣成寻山集团。

1.2 方法

1.2.1 染色体制备 选取性腺饱满、成熟度好的雌雄扇贝各10～20只,阴干刺激法[10]人工诱导使其排卵、产精后进行人工受精,待发育到担轮幼虫时期,用0.01%秋水仙素处理2.5 h;然后用0.075 mol/L KCl溶液低渗30 min,卡诺固定液(无水乙醇∶冰醋酸=3∶1)固定3次,每次15 min,-20℃冰箱中保存备用。

1.2.2 DAPI带型和PI带型 用50%的醋酸溶液解离胚胎细胞1～2 min,用气干法制片[11]。待染色体标本自然干燥(气干)后,加30μL PI(1.5μg/mL)或者DAPI(1.5μg/mL)染液于玻片上,染色10 min,Nikon E-600荧光显微镜观察,CCD拍照,LUCIA细胞遗传学工作站进行染色体初步配对分析。选取较好的10个以上中期分裂相,测量染色体的相对长度,计算臂比,按照Levan[12]的标准进行核型分析。

2 结果

2.1 DAPI染色观察结果

栉孔扇贝染色体经DAPI染色后的结果见图1,核型数据见表1。DAPI带型结果显示,栉孔扇贝染色体在传统的着丝粒区(Centromeric regions)、末端区(Terminal regions)、近着丝粒区(Pericentric regions)和中间区(Interstitial regions)显带,阳性带多分布在着丝粒区、端部以及近着丝粒区,且端部带的面积较大染色较深。在分析比较不同的栉孔扇贝染色体分裂相时发现,有些部位的DAPI带会呈现显色的改变,有时呈阴性带,有时呈阳性带。经统计比较12个不同DAPI带显示的分裂相,栉孔扇贝染色体DAPI带模式图如图2所示。

DAPI带型统计结果见表2:共有62条明暗带,分为3种类型。①阳性带,共34条带。②阴性带,共16条带。③可变带,共12条带。按照DAPI带所处的位置可以分为着丝粒区、近着丝粒区、中间区和端部共4个不同的区域。

图1 栉孔扇贝染色体DAPI带型图 (标尺=5μm)Fig.1 The DAPI-banding karyotype ofC.f arreri (scale bar=5μm)

表1 栉孔扇贝染色体相对长度、臂比的统计结果及染色体分类Table 1 Relative length、arm ratio and chromosome type ofC.f arreri

图2 栉孔扇贝DAPI带型模式图Fig.2 Idiogram of DAPI-banding ofC.f arreri

表2 栉孔扇贝染色体DAPI带统计结果Table 2 The numbers of DAPI-bands ofC.f arreri

2.2 PI染色观察结果

图3为栉孔扇贝担轮幼虫染色体经PI染色后的结果及核型。经PI染色后,统计分析15个分裂相并进行核型分析,栉孔扇贝染色体在传统的着丝粒区(Centromeric regions)、末端区(Terminal regions)、近着丝粒区(Pericentric regions)和中间区(Interstitial regions)显带,阳性带多分布在着丝粒区、端部以及近着丝粒区,且端部带的面积较大染色较深。

图3 栉孔扇贝染色体PI带型图 (标尺=5μm)Fig.3 The PI-banding karyotype ofC.f arreri(scale bar=5μm)

3 讨论

3.1 栉孔扇贝DAPI带型

荧光染料DAPI是1种双链DNA特异的染料,与DNA作用至少有2种不同的机制,在A T富含区,DAPI与双链的小沟结合,其结合量大,发出较强的荧光;在GC富含区,DAPI则插入双链的DNA之间而产生较弱的荧光或不发荧光。同时由于DAPI的结合也可能影响染色体上蛋白质结构从而产生染色体带。因此DAPI带纹在一定程度上反映了染色体DNA的分子序列和蛋白组成[13-14]。DAPI荧光显带技术在染色体未经任何化学处理的情况下,直接用DAPI进行染色,利用荧光显微镜进行观察分析,可以看到在染色体上展示出类似于C带的带纹,这种方法由于染色体未经化学处理,因此显示的带纹忠实地反映了染色体的结构和异染色质的分布[15]。目前国内外学者利用荧光染料DAPI已经构建了大麦[16]、蕹菜[17]等植物的染色体模式图;动物DAPI带型方面,在濑鱼[18]、河豚[19]、鳙鱼[20]等不同类型的鱼类染色体中亦有相关报道,这一技术在细胞遗传学研究中显示出重要的意义。

通过实验,作者发现栉孔扇贝的大部分染色体的着丝粒位置和端部位置出现DAPI深染带,而且深染带的面积很大,说明栉孔扇贝染色体的着丝粒和端部为富含AT的区域。DAPI带型在扇贝科3种扇贝中已有报道,在Hinnites distortus中,DAPI阳性带主要位于着丝粒处[21];在虾夷扇贝(Patinopecten Yessoensis)中,DAPI深染带主要存在于着丝粒区域,而少部分存在于染色体中部[22];以上2种扇贝的DAPI带型结果与本文的结果类似。而在海湾扇贝(A.irradians)中,DAPI阳性带主要出现在染色体的端部和着丝粒位置,少数带位于染色体中间位置[7]。López-Pi˜nón等[21]认为DAPI带型和C带型结果相似,都反映的是染色体上组成型异染色质区域。在扇贝科动物中,仅有海湾扇贝(A.irradians)[7]、女王扇贝(Aequipecten opercularis)[23]和Nodipecten nodosus[24]有过应用C带进行组成型异染色质分布的研究报道,主要定位在染色体的着丝粒,中间或端部区域,与DAPI带型显示的异染色质区相似。因此,作者推测栉孔扇贝、虾夷扇贝、女王扇贝等扇贝科物种其组成型异染色质区主要分布在染色体的着丝粒区域和部分端部区域,而海湾扇贝的组成型异染色质区则主要分布于染色体的端部区域。

3.2 栉孔扇贝PI带型

PI带型技术相对于其他带型技术而言,应用的报道少一些,在扇贝中的应用更是少见,仅见Zhang等[25]对海湾扇贝和虾夷扇贝进行PI带型研究,发现其结果显示出与C带相似的带型。

在本文的实验中,用荧光染料PI对栉孔扇贝染色体进行染色,发现大部分染色体的着丝粒区域和端部区域均出现PI深染带,全部染色体的长臂上均有阳性带出现。在海湾扇贝中PI阳性带主要出现在染色体的端部和着丝粒位置,少数带位于染色体中间位置,一些位于近着丝粒位置的可变带面积扩展到几乎整个短臂上,显示出在海湾扇贝短臂上分布的大量异染色质区域;而虾夷扇贝中,PI阳性带则集中在着丝粒区域[25]。PI阳性带的位置可以反映不同种类扇贝染色体上组成型异染色质分布情况的差异,使用荧光染料PI对栉孔扇贝染色体进行处理,显示了与DAPI带以及C带相似的结果,表明PI带型也可以成为核型及带型分析中的1个新的指标。

经过20多年的发展,染色体带型技术正在逐渐走向成熟,比如C带,银染带等技术,而且它们已被广泛地应用于哺乳动物[26]、植物[27]以及鱼类[28]等染色体的研究中。在一些模式生物染色体带型研究中,带型技术都显示出了较好的稳定性和可靠性,在核型分析、染色体鉴定方面都起到了很重要的作用,正是有鉴于此,本文将带型技术引入到扇贝染色体的研究当中,希望通过带型分析,尝试进行扇贝染色体的区分鉴定。通过实验发现,栉孔扇贝染色体的DAPI带型以及PI带型染色面积比较大,阴性带与阳性带的差异并不明显,且存在一定数量的可变带,稳定性相对较低。推测其中的原因,可能是扇贝染色体结构与其他生物相比有一定差别,4种碱基的分布相对比较均匀,AT富含区或者GC富含区相对较少,因此很难出现非常清晰且稳定的阳性带或阴性带。尽管可以通过染色体的大小和形态以及带纹的多少、深浅来进一步加以辨别,但还是难以做到通过一系列处理后,能够一目了然地把每条染色体区分开来。所以作者认为,在其他生物染色体研究中已经发展成熟的带型技术,其方法及流程在扇贝染色体研究中还存在着可以提升与改进的地方,在本实验室的后续工作中,作者正在将带型技术与荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization, FISH)结合起来,通过基因定位[2,7,22,29],提供更加清晰稳定的染色体标记来实现扇贝染色体的区分鉴定。

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Abstract: In this paper,the techniques including DAPI-staining and PI-staining were used to study the DAPI-banding and PI-banding patterns ofChlamys f arreri.Chromosomes spread from trochophore were prepared by Colchine-hypotonic-air drying methods.The results showed that DAPI-bands displayed in all the chromosomes ofC.f arreri,and they were mostly distributed in centromeric regions and terminal regions.Some interstitial bands and variable bands were also observed.62 DAPI positive bands were recorded in 12 chromosome metaphases.In addition,PI positive bands also displayed in all the chromosomes, and their positions were similar to that of the DAPI-bands.Both the positive DAPI-bands and the positive PI-bands distributed in the heterochromatin regions ofC.f arrerichromosomes.

Key words: Zhikong scallop(Chlamys f arreri);chromosome;DAPI-banding;PI-banding

责任编辑 于 卫

DAPI-Banding and PI-Banding of Zhikong Scallop(Chlamys farreri)

XU Jun1,2,BAO Zhen-Min1,REN Xiao-Liang1,WANG Shan1,HU Li-Ping1,HUANG Xiao-Ting1
(1.Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding,Ministry of Education,Ocean University of China,Qingdao 266003, China;2.Shanghai Pharmaceutical School,Shanghai 200135,China)

S917.4

A

1672-5174(2011)04-077-05

国家高技术研究发展计划项目(2006AA10A408,2010AA10A401);国家自然科学青年基金项目(30901096);中国科学院实验海洋生物学重点实验室开放基金项目(KFN92007NO12)资助

2010-05-12;

2010-09-13

徐 俊(1979-),女,硕士,讲师。E-mail:victory0086@hotmail.com

E-mail:xthuang@ouc.edu.cn