纺锤体检查点蛋白Cenp-E过低表达与肝癌细胞染色体异常的关系

蔡 勇,彭爱红

（1.湖南博雅眼科医院检验科，湖南 长沙 410007；2.湖南省临床检验中心，湖南 长沙 410007）

早在1914年，德国科学家Theodor Boveri就认为恶性细胞有不稳定的染色体，这些不稳定染色体能导致癌症的发生。1998年，Peter等提出了非整倍体导致癌症发生的假说，他们的实验表明非整倍体是独立于基因突变外导致癌症发生的机制[1]。SCP的功能就是监测细胞染色体分离。检查点功能丧失的一个后果是遗传不稳定性,促使细胞更容易恶变[2]。本试验通过间接免疫荧光和RNAi技术在HepG-2和LO2细胞中研究Cenp-E在HepG-2细胞染色体数目异常发生过程的作用，以期能够发现Cenp-E在肿瘤细胞染色体数目异常中所起作用。

1 材料与方法

1.1 材料

HepG-2细胞和LO2细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库，CENP-E兔一抗，罗丹明标记Cenp-E红色荧光二抗购自Santa-Cruz公司。Alexa flour 350 Tubule蓝色二抗购自AB公司。DMEM培养基，胎牛血清购自美国GIBICO公司。DIPA染料购自Sigma公司。Trizol试剂购自Invitroge公司，PrimeScript RT试剂盒购自 TaKaRa公司，质粒抽提试剂盒购自上海华舜公司。Lipofectamine 200购自Invitrogen公司。

1.2 shRNA设计及质粒的构建

用Invitrogen公司在线设计软件，设计以Gen-Bank中CENP-E基因(编号NM.001813)的编码区(CDS)为靶向的shRNA引物:正义链5'-GATCCCG-cACCG- ATGCTGGTGACCTCCAACAGAGAGCTCACCACCATCCGTGCTA-3',反义链5'-AGCTYAAAAAAGCACGCATGCTGGTGACCTCTCTCT FGAAGAGGTCACCAGCATCCGTGCGG-3'。

用BLAST软件进行同源性分析证实为靶基因高度保守区段后，送上海Invitrogen公司采用化学合成方法合成单链寡核苷酸；退火形成双链DNA，插入线性载体pGenesil.1质粒中；转化至感受态大肠埃希菌DH5a后，挑选单克隆，经扩增，抽提质粒，双酶切鉴定和DNA测序分析。

1.3 转染质粒DNA及实验分组

转染的前一天将LO2细胞传代到24孔板内，细胞密度为 1×105～2×105/孔，培养 12 h 以上，当细胞密度达80%左右时即可进行转染。……