金属离子对木聚糖酶制备阿魏酸糖酯的影响

赵 冰，刘海顺，王 静,，张 可，孙宝国，曹雁平

(1.北京工商大学 北京市植物资源研究开发重点实验室，北京 100048；2.食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京 100048；3.中储粮北京分公司承德粮油质检中心，河北省承德市双滦区东平台，河北 承德 067001；4.空军航空医学研究所，北京 100142)

金属离子对木聚糖酶制备阿魏酸糖酯的影响

赵 冰1,2，刘海顺3，王 静1,2,*，张 可4，孙宝国1,2，曹雁平1,2

(1.北京工商大学 北京市植物资源研究开发重点实验室，北京 100048；2.食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京 100048；3.中储粮北京分公司承德粮油质检中心，河北省承德市双滦区东平台，河北 承德 067001；4.空军航空医学研究所，北京 100142)

采用木聚糖酶制备小麦麸皮中的阿魏酸糖酯。结果表明：添加金属离子会明显影响木聚糖酶的活性，K+、Ca2+、Mn2+、Ag+、Zn2+、Co2+对木聚糖酶有激活作用，其中Mn2+、Ag+、Zn2+、Co2+有较强的激活作用；而EDTA、Sn2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+、Mg2+对木聚糖酶有抑制作用，而且高浓度的金属离子也会抑制木聚糖酶的活性。在制备阿魏酸糖酯时添加一定浓度对木聚糖酶有激活作用的金属离子，可以降低木聚糖酶的添加量。

麦麸；金属离子；木聚糖酶；阿魏酸糖酯

小麦是世界上最重要的粮食作物，约占世界粮食产量的三分之一[1]，小麦麸皮的主要成分是非淀粉多糖，约占46%[2]，小麦麸皮中含有很多天然活性成分，如低聚糖、膳食纤维、酚酸类物质等，其中阿魏酸作为细胞壁中含量最高的酚酸类物质，含量可以达到麦麸质量的0.4%～0.7%。在自然界中，大部分阿魏酸是以结合态存在的，对麦麸进行一系列的处理可以得到带有阿魏酸基团的活性物质。

近年来，阿魏酸糖酯(FOs)引起了许多研究人员的兴趣，阿魏酸糖酯可以抑制Cu2+诱导人体低密度脂蛋白的过氧化反应[3]、清除自由基，对AAPH损伤人红细胞的保护[4]，螯合金属离子，促进双歧杆菌的生长[5]等作用，是一种非常有应用前景的抗氧化剂。内切木聚糖酶酶解小麦麸皮能够产生阿魏酸糖酯，当不同类型和不同浓度的金属离子作用于木聚糖酶时，木聚糖酶显示出不同的活性，进而影响阿魏酸糖酯的产量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦麸皮，粉碎后过40目筛备用。

α-淀粉酶(α-Amylase)、糖化酶 北京奥博兴生物技术有限责任公司；碱性蛋白酶(Alcalase) 丹麦诺维信公司；华扬木聚糖酶 武汉新华扬生物有限公司；木聚糖 美国Sig-Ald公司。

1.2 仪器与设备

紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；SHZ-82A恒温振荡器 常州国华电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 木聚糖酶酶活性的测定方法

按照参考文献[6]测定。

1.3.2 木聚糖酶最适反应参数的测定

按照参考文献[6-8]测定。

1.3.2.1 最适温度及热稳定性

在40～80℃之间测定酶活力，酶活力最高时的温度的即为酶的最适温度；将酶在不同的温度下保温1h后，迅速流水冷却至室温，再测定酶的残余酶活力，以在30℃条件下保存的酶为标准，其他各组与其进行比较。

1.3.2.2 最适pH值及pH值稳定性

使用醋酸盐缓冲液来研究pH值对木聚糖酶酶活的影响。配制50mmol/L的各种pH值的缓冲液，用不同pH值的缓冲液配制酶和底物，酶活力最高的即为酶的最适pH值；将酶在不同的pH值的缓冲液中室温下保温1h后，再测定酶的残余酶活力，以未保温的酶为标准，其他各组与其进行比较。

1.3.3 金属离子对木聚糖酶活性的影响[9-11]

在稀释好的木聚糖酶溶液中分别加入4mmol/L的KCl、CaCl2、MnCl2、SnCl2、AgNO3、ZnCl2、FeCl2、FeCl3、HgCl2、MgCl2、CoCl2、EDTA，然后将其在30℃保温30min，迅速冷却，加入1mL 10mg/mL的木聚糖溶液，然后按照1.3.1节的方法进行测定，以没有加金属离子的酶液作对照。比较它们的活性。通过以上实验获得对木聚糖酶有激活作用的金属离子，然后进一步研究最适宜的金属离子的浓度，分别配制10、20、30、40、50、60、70、80mmol/L的对木聚糖酶有激活作用的金属离子溶液，按照1.3.2节的方法测定木聚糖酶的酶活力。

1.3.4 加入金属离子对木聚糖酶制备阿魏酸糖酯的影响

以小麦麸皮为原料制备不溶性膳食纤维[12]，再用木聚糖酶酶解不溶性膳食纤维制备阿魏酸糖酯[13]，以不同浓度的木聚糖酶处理不溶性膳食纤维，比较产生的阿魏酸糖酯的浓度。

实验分实验组和对照组。实验组是Z n2+浓度为20mmol/L的MOPS缓冲液，而对照组仅仅是MOPS缓冲液，分别用两种溶液配制质量浓度为1、2、3、4、5g/L的木聚糖酶溶液，料液比1:10，在60℃反应36h，然后测定阿魏酸糖酯的浓度。

阿魏酸糖酯的浓度通过双波长的方法进行测定[14-16]：在100mmol/L、pH6.0的MOPS缓冲液中，阿魏酸在286nm波长处有最大吸收，阿魏酸糖酯在325nm波长处有最大吸收，在这两个波长下，它们的摩尔消光系数分别为：阿魏酸ε286nm=14176L/(mol·cm)和ε＇286nm=12465L/(mol·cm)，阿魏酸糖酯ε325nm=10350L/(mol·cm)和ε＇325nm=19345 L/(mol·cm)。木聚糖酶水解小麦麸皮不溶性膳食纤维产生的阿魏酸糖酯的浓度([FOs])按照下面的公式进行计算。

2 结果与分析

2.1 木聚糖酶酶活的测定及最适反应参数的确定

图1 木聚糖酶的酶活性随温度的变化Fig.1 Change of xylanase activity with heating temperature

图2 木聚糖酶的热稳定性Fig.2 Effect of temperature on xylanase stability

图3 木聚糖酶的酶活性随pH值的变化Fig.3 Change of xylanase activity with pH values

图4 木聚糖酶的pH值稳定性Fig.4 Effect of pH on xylanase stability

通过测定得到木聚糖酶的酶活为60233.33U。由图1可知，木聚糖酶的活力在60℃达到最大，在60～70℃之间基本保持不变，从70℃开始急剧下降；由图2可知，随着温度的升高，木聚糖酶的活力逐渐降低，60℃以后急剧下降。因此，可以确定木聚糖酶的最适反应温度为60℃。由图3可知，木聚糖酶在pH5.0达到最大，结合图4木聚糖酶的pH值稳定性的结果，可以确定木聚糖酶的最适pH值为5.0。

2.2 金属离子对木聚糖酶活性的影响

选择浓度为4mmol/L的各种金属离子与木聚糖酶作用，在25mL的具塞比色管中分别加入1mL木聚糖酶溶液和1mL金属离子溶液保温后测定木聚糖酶的酶活，以不加金属离子的酶活为100%。

图5 不同金属离子对木聚糖酶酶活性的影响Fig.5 Effect of different metal ions on the activity of xylanase

由图 5 可知，K+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Co2+对木聚糖酶有激活作用，而EDTA、Sn2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+、Ag+、Mg2+对木聚糖酶有不同程度的抑制作用，其中Mn2+、Zn2+、Co2+对木聚糖酶有较高的激活作用，4mmol/L Mn2+可以使木聚糖酶的酶活提高120%以上。为了进一步确定Mn2+、Zn2+、Co2+对木聚糖酶的最适添加浓度，选择浓度分别为10、20、30、40、50、60、70、80mmol/L的Mn2+、Zn2+、Co2+溶液，使其与木聚糖酶作用，进一步测定其酶活，以不添加金属离子的酶活为100%。3种不同浓度的金属离子对木聚糖酶的作用效果如图6～8所示。

图6 不同浓度的Zn2+对木聚糖酶酶活性的影响Fig.6 Effects of Zn2+concentration on the activity of xylanase

由图6可知，Zn2+的浓度在10～40mmol/L之间时，Zn2+对木聚糖酶的激活作用在一直增加，在40mmol/L达到最大，可以达到对照的170%，而继续增加Zn2+的浓度，其又会对木聚糖酶产生抑制作用。

图7 不同浓度的Mn2+对木聚糖酶酶活性的影响Fig.7 Effects of Mn2+concentration on the activity of xylanase

由图7可知，Mn2+的浓度在0～20mmol/L之间时，Mn2+对木聚糖酶的激活作用在一直增加，在20mmol/L达到最大，可以达到对照的125%以上，继续增加Mn2+的浓度，又会对木聚糖酶产生抑制作用。

图8 不同浓度的Co2+对木聚糖酶酶活性的影响Fig.8 Effects of Co2+concentration on the activity of xylanase

由图8可知，对于Co2+来说，它对木聚糖酶的激活作用在较低的浓度就可以达到最高，在0～6mmol/L的浓度范围内，Co2+对木聚糖酶的激活作用一直在增加，在6mmol/L达到最高，可以达到对照的120%左右，但是随着Co2+浓度的增加又会抑制木聚糖酶的活性，该木聚糖酶对Co2+的耐受强度较低，在达到16mmol/L时木聚糖酶的酶活就只有对照的60%左右。

因此，不同浓度、不同种类的金属离子对木聚糖酶的影响是不同的，因此需要找到最适宜的金属离子的浓度。对于抑制的机理可能是：金属离子能与木聚糖酶活性中心的半胱氨酸残基上的巯基结合，抑制酶的活性，或者是酶的非活性中心部分与金属离子结合，使结构发生变形，使酶活性减弱；对于激活的机理可能是木聚糖酶是金属酶，而且很多金属离子有络合作用，金属离子更容易维持H+浓度的稳定，同时添加金属离子也可以改变酶所处的缓冲溶液的离子强度。

2.3 加入金属离子对木聚糖酶制备阿魏酸糖酯的影响

图9 金属离子对FOs产量的影响Fig.9 Effects of metal ions on the production of FOs

由图9可知，添加Zn2+的实验组木聚糖酶质量浓度在0.6g/L时阿魏酸糖酯的含量就可以接近对照组木聚糖酶质量浓度为1g/L时阿魏酸糖酯的含量。但是阿魏酸糖酯的最高含量基本上没有变化，这说明一定浓度的Zn2+仅仅能够提高木聚糖酶的活性，对于阿魏酸糖酯的产量提高并没有太大的帮助。

3 结 论

3.1 金属离子对木聚糖酶的活性有较大的影响：K+、Ca2+、Mn2+、Ag+、Zn2+、Co2+对木聚糖酶有激活作用，而 EDTA、Sn2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+、Mg2+会抑制木聚糖酶的酶活，其中Mn2+、Ag+、Zn2+、Co2+有较强的激活作用，其中Zn2+的浓度达到40mmol/L时木聚糖酶酶活性达到最高，而且高浓度的金属离子会抑制木聚糖酶的活性。

3.2 当使用含有金属离子的木聚糖酶制备阿魏酸糖酯的时候发现，质量浓度为0.6g/L的木聚糖酶添加Zn2+后，魏酸糖酯的含量和1g/L木聚糖酶不添加金属离子的阿魏酸糖酯的含量，由于木聚糖酶较高的价格使得通过使用金属离子激活木聚糖酶的活性来减少木聚糖酶的使用量成为可能，在工业生产中具有很好的应用前景。

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Influence of Ions on Feruloyl Oligosaccharide Preparation from Wheat Bran by Xylanase Hydrolysis

ZHAO Bing1,2，LIU Hai-shun3，WANG Jing1,2,*，ZHANG Ke4，SUN Bao-guo1,2，CAO Yan-ping1,2
(1. Beijing Key Laboratory of Plant Resource Research and Development, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China；2. Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, Beijing 100048,China；3. Chengde Grain Quality Test Center, China Grain Reserves Corporation Beijing Branch, Shuangluan District, Chengde 067001, China；4. Air Force Institute of Aviation Medicine, Beijing 100142, China)

The feruloyl oligosaccharide was prepared from wheat bran by xylanase. The results indicated that the activity of xylanase was strongly affected by metal ions. K+, Ca2+, Mn2+, Ag+, Zn2+, and Co2+could activate xylanase, and Mn2+, Ag+, Zn2+and Co2+showed stronger promoting effect. The activating effect of Zn2+was positively dependent on its concentration within a certain range, but excessively high concentration inhibited the activity of the enzyme. However, EDTA, Sn2+, Fe2+, Fe3+, Hg2+and Mg2+were inhibitors of the enzyme. Less xylanase was required when adding a certain concentration of metal ions during preparation of feruloyl oligosaccharide.

wheat bran；metal ions；xylanase；feruloyl oligosaccharide

Q814

A

1002-6630(2011)03-0019-04

2010-03-30

北京市教育委员会面上项目(KM200910011002)；北京市科技新星项目(2008B07)

赵冰(1986—)，男，硕士研究生，研究方向为农副产品资源的开发利用。E-mail：zhaobtg@163.com

*通信作者：王静(1976—)，女，副教授，博士，研究方向为农副产品资源的开发利用。E-mail： jwang810@yahoo.com.cn