复合乳酸菌发酵产双乙酰的研究

汪 薇，肖燕清，白卫东

(仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州 510225)

复合乳酸菌发酵产双乙酰的研究

汪 薇，肖燕清，白卫东*

(仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州 510225)

选用瑞士乳杆菌和乳酸乳球菌混合发酵产双乙酰。研究表明，当发酵时间、发酵温度、牛奶与奶油浓度之比、反应体系的pH、乳糖添加量和柠檬酸添加量分别为32h、37℃、3∶1、6.5、1.0%和2.0%时，双乙酰的产量达到了125mg/L。此外，添加乳糖和柠檬酸能大大促进产物双乙酰的积累。

双乙酰，发酵，乳酸菌

双乙酰，又名丁二酮、联乙酰等，经稀释后呈强烈的奶油香气，是乳制品中一种重要的风味物质，主要用于配制奶制品香精(黄油、乳酪、牛奶、酸乳酪)和香草、巧克力、糖果、坚果、咖啡以及水果等香精。天然的双乙酰存在于茴香μ月桂油、香旱芹子油、树莓、水仙μ郁金香μ覆盆子μ草莓μ熏衣草μ香茅、岩蔷薇及奶油中。在食品工业中，双乙酰主要用作软饮料μ冷饮μ焙烤食品糖果等的增香剂，在乳发酵制品的滋味与香味中，双乙酰也是起作用的重要化合物之一［1］。目前国内双乙酰的生产工艺主要是采用亚硝化法，但该工艺在制备过程产生大量硫酸氢钠，难以回收，且亚硝酸类物质毒性大、沸点低，对环境危害严重［2］。随着人们生活水平的提高，以及对食品安全的关注度不断提升，其使用效果和安全性已经不能满足消费者和食品香精香料行业的发展需求。于是，国内外的研究重点转向了采用崇尚自然、回归自然的微生物发酵法来制备双乙酰。不同微生物产双乙酰的能力差别较大，Anuradha等利用乳酸菌发酵产双乙酰，其产量达64mg/g葡萄糖［3］;Jyoti等选择不同的底物进行发酵，双乙酰最高产量可达0.1g/g葡萄糖［4］;东北农业大学于鹏等人对乳酸乳球菌乳酸亚种采用亚硝基胍进行诱变选育，但其产量仅为0.72mg/L［5］;北京工商大学宋焕禄等发酵柠檬酸盐产双乙酰，最高产量为98mg/L［6］。本文利用两株乳酸菌进行混合发酵，研究了不同发酵条件以及添加碳源和柠檬酸盐对该复合乳酸菌发酵产双乙酰的影响，建立了一条高产双乙酰的发酵路线。

1 材料与方法

1.1 实验材料

瑞士乳杆菌(GIM 1.157) 购自广东省微生物研究所;乳酸乳球菌乳亚种6018 购自中国工业微生物菌种保藏管理中心;脱脂奶粉 新西兰进口分装;无盐奶油 上海光明乳业股份有限公司;其他试剂 均为市售分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵方法 用脱脂奶粉配制10%的牛奶，取等量10%的牛奶与奶油在三角瓶中搅拌均匀，于85℃水浴灭菌15m in，降至室温后，接入10%活化好的复合乳酸菌，其中，瑞士乳杆菌和乳酸乳球菌的菌量为1∶1，于恒温摇床中37℃进行发酵28h后，取样测量双乙酰含量。

1.2.2 双乙酰含量的测定［7］

1.2.2.1 双乙酰标准曲线的测定 用脱脂奶粉配制10%的牛奶，于121℃灭菌10m in后迅速冷却，加等体积16%三氯乙酸溶液，混匀，3500×g离心10min，然后分别取上清液10m L加入两支试管(1号和2号)中，其中1号管中加入1%的邻苯二胺溶液0.5m L，2号管不加。两管摇匀后置于黑暗处放置30m in，然后分别向1号管和2号管中加入4.0mol/L HCl溶液2.0m L和2.5m L终止反应。以2号管作为参比，利用紫外－可见分光光度计在335nm波长下测定其OD值。每样至少做2个平行，取平均值，然后以双乙酰浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.2.2 样品中双乙酰含量的测定 取待测乳样，加等体积16%三氯乙酸溶液，混匀，3500×g离心10m in，取澄清的上清液稀释至适当浓度，按照1.2.2.1中的方法对样品中双乙酰的含量进行测定。

2 结果与分析

2.1 发酵时间对复合乳酸菌发酵产双乙酰的影响

由图1可知，复合乳酸菌对底物奶油和牛奶的混合物进行发酵，随着发酵时间的延长，双乙酰的产量明显提高，当发酵时间为32h时达到最高，约为55mg/L，之后，随着发酵时间的延长，双乙酰的产量略有减少，当发酵时间超过36h，双乙酰的产量迅速下降。根据Kempler和Mckay提出的双乙酰的发酵代谢途径［8］，这可能是因为发酵所得的双乙酰能在3－羟基丁酮脱氢酶的作用下可逆地生成3－羟基丁酮，并进一步转化为2，3－丁二醇所致。因此，发酵时间过长会导致双乙酰产量的下降。综上可知，适宜的发酵时间为32h。

图1 发酵时间对复合乳酸菌发酵产双乙酰的影响

2.2 发酵温度对复合乳酸菌发酵产双乙酰的影响

微生物细胞内的酶类对温度比较敏感，温度过高会使其钝化，而温度过低会抑制酶的活性。取等量的10%的牛奶与奶油在三角瓶中搅拌均匀，于85℃水浴灭菌15m in，降至室温后，接入10%活化好的复合乳酸菌，于不同温度的恒温摇床中进行发酵32h后，测量双乙酰含量，结果如图2所示。当发酵温度低于37℃时，温度的升高有利于双乙酰的累积;当发酵温度高于37℃，双乙酰的产量迅速下降，原因可能涉及两个方面，一方面，这可能是由于随着温度的升高，细胞内酶变性失活的速度增大，从而使酶促反应速度急剧下降，产物的产量也随之减少;另一方面，一般乳酸菌的适宜生长温度也是37℃，当发酵温度与生长温度一致时，有利于反应所需酶系的分泌，保证酶活性的稳定，有利于该反应的进行。

2.3 底物浓度之比对复合乳酸菌发酵产双乙酰的影响

本研究采用不同比例的10%的牛奶与奶油的混合物，接入活化好的复合乳酸菌，于37℃的恒温摇床中进行发酵32h后，测量双乙酰含量。由图3可知，牛奶与奶油的比例对双乙酰产量的影响比较显著。当牛奶与奶油的浓度之比为5.0时，双乙酰产量不到15mg/L，随着牛奶比例的减少，奶油比例的增加，双乙酰的产量显著增加，当两者比例为3.0时，双乙酰产量达到了67mg/L。之后，随着奶油所占比例的继续增加，双乙酰的产量缓慢下滑。可见，适宜的底物浓度之比为牛奶与奶油比例为3.0。

图2 发酵温度对复合乳酸菌发酵产双乙酰的影响

图3 底物浓度之比对复合乳酸菌发酵产双乙酰的影响

2.4 反应体系的pH对复合乳酸菌发酵产双乙酰的影响

反应体系pH的改变会影响细胞内酶分子的活性构象，影响底物与酶分子的“诱导契合”，进而影响酶反应速度。此外，反应体系的pH还会影响细胞膜所带的电荷、底物和产物分子的离子化程度，从而影响微生物细胞的生物转化。鉴于此，对比研究了复合乳酸菌细胞在不同反应体系pH环境下发酵产双乙酰的情况，考察了不同反应体系pH对该反应的影响规律。

本研究所采用的底物为3∶1的10%的牛奶和奶油，搅拌均匀并调节其pH，灭菌后接入活化好的复合乳酸菌，于恒温摇床中37℃进行发酵32h后，取样测量双乙酰含量，结果如图4所示。随着反应体系的pH从3.5升至6.5，复合乳酸菌发酵所得双乙酰的产量随之迅速增加，并均在pH为6.5时达到最高，当反应体系的pH继续升高，双乙酰的产量出现明显的下降趋势，这可能是近中性的pH环境不适合乳酸菌的生长，进而导致相关酶系的分泌减少所致。综合考虑，复合乳酸菌细胞发酵制备双乙酰的最适pH选择6.5为宜。

图4 反应体系的pH对复合乳酸菌发酵产双乙酰的影响

2.5 添加不同碳源对复合乳酸菌发酵产双乙酰的影响

根据Kempler和Mckay提出的双乙酰的发酵代谢途径［8］，微生物细胞对糖类物质进行代谢，转化为葡萄糖后进入糖酵解途径，进而转化为丙酮酸，再进一步转化为双乙酰。于是，我们尝试向反应体系中添加不同碳源，考察其对复合乳酸菌发酵产双乙酰的影响。本研究以牛奶和奶油为底物，调节其pH为6.5，并尝试添加不同碳源，然后接入复合乳酸菌，于恒温摇床中37℃进行发酵32h后，取样测量双乙酰含量。由图5可知，在添加的几种碳源中，复合乳酸菌对乳糖的利用效率最高。以乳糖为碳源时，双乙酰的产量达到了78mg/L。复合乳酸菌对果糖、葡萄糖、蔗糖和木糖的利用效率均不够理想，这可能是因为所选用的复合乳酸菌内的半乳糖苷酶、半乳糖激酶比较丰富，因此能大量代谢乳糖生成双乙酰，故而选择乳糖作为适宜的碳源。

图5 添加不同碳源对复合乳酸菌发酵产双乙酰的影响

2.6 乳糖添加量对复合乳酸菌发酵产双乙酰的影响

复合乳酸菌能利用乳糖作为底物转化为双乙酰。一般来说，对于生物催化过程而言，底物在适宜的范围内有利于产物的生成，当底物浓度超过一定范围，可能导致底物抑制，影响产物的积累。为此，对比研究了不同乳糖添加量对复合乳酸菌细胞发酵产双乙酰的影响。本研究以牛奶和奶油为底物，调节其pH为6.5，添加不同含量的乳糖，然后接入复合乳酸菌，于恒温摇床中37℃进行发酵32h后，取样测量双乙酰含量。由图6可知，不添加乳糖时，双乙酰产量仅为67mg/L。当添加乳糖之后，双乙酰产量迅速增加，所添加的乳糖量为1.0%时，双乙酰产量达到了98mg/L，之后随着乳糖添加量的继续增加，双乙酰产量明显下降，这可能是过高的乳糖浓度导致底物抑制所致。综上可知，乳糖添加量为1.0%较为适宜。

图6 乳糖添加量对复合乳酸菌发酵产双乙酰的影响

2.7 柠檬酸添加量对复合乳酸菌发酵产双乙酰的影响

由于乳酸菌还可利用柠檬酸产生丙酮酸，进而合成双乙酰，此外，柠檬酸的加入可部分阻遏丁二酮还原酶的产生，促进双乙酰的积累［6］，因此，本文尝试向反应体系中添加柠檬酸，考察其对复合乳酸菌发酵产双乙酰的影响。本研究以牛奶和奶油为底物，调节其pH为6.5，添加1%的乳糖和不同含量的柠檬酸，然后接入复合乳酸菌，于恒温摇床中37℃进行发酵32h后，取样测量双乙酰含量。由图7可知，添加适量的柠檬酸的确能促进双乙酰的积累，当柠檬酸的添加量达到2.0%时，双乙酰的产量高达125mg/L，当柠檬酸添加量继续增加，双乙酰的产量出现较明显的下降趋势，这可能也是底物抑制所致，所以柠檬酸的添加量选择2.0%为宜。

图7 柠檬酸添加量对复合乳酸菌发酵产双乙酰的影响

3 结论

本文以牛奶和奶油为底物，选用瑞士乳杆菌和乳酸乳球菌混合发酵产双乙酰。研究表明，添加乳糖和柠檬酸能大大促进产物双乙酰的积累，当发酵时间、发酵温度、牛奶与奶油浓度之比、反应体系的pH、乳糖添加量和柠檬酸添加量分别为32h、37℃、3∶1、6.5、1.0%和2.0%时，双乙酰的产量最高，达到了125mg/L，较之国内外目前的报道有明显的提高。下一步，本课题组一方面将研究选择廉价易得的底物进行发酵制备双乙酰，以降低生产成本;另一方面，探究所选用菌种的生长特性、代谢途径及其协同作用，以进一步提高双乙酰产量。

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［7］邵亚东.传统发酵乳制品中乳酸菌产双乙酰特性的研究［D］.内蒙古:内蒙古农业大学，2007.

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Production of dimethylglyoxal fermented by compound lactobacillus

WANG Wei，XIAO Yan－qing，BAI Wei－dong*

(College of Light Industry and Food Science，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，China)

Production of dimethylglyoxal fermented by lactobacillus helveticus and lactococcuslac tis was conducted.The result showed that when fermentation time，fermentation temperature，the ratio of milk to c ream，pH of the reaction system，the addition amount of lactose and the addition amount of citric acid were 32h，37℃，3∶1，6.5，1.0%and 2.0%，respectively，the yield of dimethyl glyoxal reached 125mg/L.Additionally，the addition of lactose and citric acid could greatly promote the accumulation of dimethylglyoxal.

dimethylglyoxal;ferment;lactobacillus

TS201.3

A

1002－0306(2011)07－0214－03

2010－03－07 *通讯联系人

汪薇(1981－)，女，讲师，主要从事香精香料的开发利用。

广州市黄埔区科技计划项目(1025);仲恺农业工程学院自然科学基金(G3091415)。