非小细胞肺癌中DPC4基因的表达与bcl-2及VEGF之间的关系

何 玲 ，尚丽娜 ，杨 磊 ，李晓琴 ，李 敏

（1.兰州大学基础医学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省肿瘤医院，甘肃 兰州 730050）

非小细胞肺癌中DPC4基因的表达与bcl-2及VEGF之间的关系

何 玲1，2，尚丽娜2，杨 磊2，李晓琴3，李 敏1

（1.兰州大学基础医学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省肿瘤医院，甘肃 兰州 730050）

目的研究DPC4（Deleted in Pancreatic Carcinoma Locus 4，DPC4）基因在非小细胞肺癌中的表达及其与凋亡抑制蛋白bcl-2及血管内皮细胞生长因子（VEGF）的关系。方法利用免疫组织化学SP法检测65例非小细胞肺癌组织和18例癌旁正常肺组织中DPC4、bcl-2和VEGF的表达。结果DPC4在非小细胞肺癌中的阳性率为50.8%（33/65），在癌旁正常肺组织中的阳性率为77.8%（14/18），2者之间的比较有显著性差异（P<0.05）；DPC4与性别、年龄及病理类型无关（P>0.05），但与非小细胞肺癌的分期、分级和淋巴结转移显著相关（P<0.05）；65例非小细胞肺癌中，DPC4的表达与bcl-2、VEGF均呈负相关。结论DPC4基因的缺失可能与非小细胞肺癌的恶性进展如分期、分级及淋巴结转移有关，DPC4基因的缺失可能抑制非小细胞肺癌细胞凋亡并上调VEGF表达来促进血管的生成。

DPC4；非小细胞肺癌；免疫组织化学；VEGF；bcl-2

DPC4(Deleted in Pancreatic Carcinoma Locus 4)是近年发现的一种新的肿瘤抑制基因，在胰腺、胆道、结肠等胃肠道肿瘤发生发展过程中发挥着重要作用，其蛋白产物Smad4介导对TGF-β家族的应答，在TGF-β受体信号传递途径中具有重要的作用。但DPC4在肺癌中的表达与凋亡抑制蛋白bcl-2及VEGF之间的关系到目前为止还不甚清楚。本研究应用免疫组化SP法检测了65例肺癌组织和18例相应的癌旁正常肺组织DPC4基因的蛋白表达，以探讨其在肺癌发病机制中的作用及其与凋亡抑制蛋白bcl-2及VEGF之间的关系，为今后以DPC4基因为靶点对肺癌进行基因治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料

65例肺癌标本及18例癌旁正常组织均为甘肃省肿瘤医院2008年5月～2010年3月经病理证实的手术切除组织。65例肺癌患者中，男50例，女15例，年龄32～81岁，平均年龄为60岁。其中鳞癌38例，腺癌27例；高分化癌17例，中分化癌34例，低分化癌14例；有淋巴结或远处转移者31例，无转移者34例。18例癌旁正常组织为对照组。所有标本均经10%中性福尔马林液固定，石蜡包埋，连续4 μm切片，并进行HE染色。

1.2 试剂和方法

鼠抗人DPC4、bcl-2和VEGF单克隆抗体购自Maxim-Bio公司，均为即用型。免疫组织化学SP试剂盒为北京中杉金桥产品。实验步骤严格按试剂盒说明进行，PBS代替一抗作阴性对照，以已知阳性片作阳性对照，用DAB显色，苏木精复染。

1.3 免疫组织化学结果判断

DPC4、bcl-2和VEGF免疫组织化学结果以细胞质内出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。显微镜下观察DPC4、bcl-2和VEGF蛋白的分布、阳性强度和阳性率。先按染色强度打分:0分为无色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色，染色强度需与背景着色相对比；再按阳性细胞所占百分比打分:0分为阴性，1分为阳性细胞≤10%，2分为11%～50%，3分为51%～75%，4分为>75%，染色强度与阳性细胞百分比的乘积≥2分为免疫反应阳性（+）。

1.4 统计学处理

所有数据均使用SPSS 11.5统计软件进行分析，DPC4的表达与不同临床病理参数的关系采用χ2检验，DPC4和bcl-2、VEGF的关系采用Spearman相关分析。

2 结果

2.1 DPC4、bcl-2和VEGF在肺癌组织及癌旁正常组织中的表达

DPC4阳性表达主要定位在癌旁正常组织的气管上皮细胞及肿瘤细胞的胞质上（见图1、图2）。癌旁正常组织及癌组织的阳性率分别为77.8%（14/18）和50.8%（33/65），癌旁正常组织中DPC4的表达明显高于癌组织（P<0.05）。bcl-2和VEGF的阳性表达主要定位在细胞胞质（见图3、图4）。肺癌组织中VEGF、bcl-2阳性表达率分别为80.2%（53/65）和53.8%（35/65），癌旁正常组织中VEGF、bcl-2 阳性表达率分别为 44.4%（8/18） 和 11.1%（2/18），肺癌中VEGF、bcl-2的阳性表达显著高于癌旁正常组织（P<0.05）。

图1 DPC4在癌旁正常肺组织中呈高表达（SP×100）

图2 DPC4在中分化肺鳞癌组织中呈低表达（SP×200）

图3 bcl-2在高分化肺腺癌中呈阳性表达（SP×200）

图4 VEGF在高分化肺腺癌中呈阳性表达（SP×40）

2.2 肺癌中DPC4的表达与临床病理特征的关系（见表1）

表1 DPC4的表达与肺癌临床病理特征之间的关系

由表1可知，65例肺癌组织中Ⅰ-Ⅱ期的肺癌组织中DPC4的阳性率显著高于Ⅲ-Ⅳ期肺癌组织（P<0.05），而且随着分化程度的降低，DPC4的阳性率逐渐降低，2者之间的比较有极著性差异（P<0.01）。65例肺癌中有淋巴结转移的肺癌组DPC4阳性率显著低于无淋巴结转移组（P<0.05）。肺癌中DPC4表达在患者的性别、年龄、病理类型间比较，无显著性差异（P＞0.05）。

2.3 肺癌中DPC4表达与bcl-2及VEGF表达之间的关系（见表2）

表2 肺癌中DPC4表达与bcl-2及VEGF表达之间的关系

对65例肺癌组织中DPC4、bcl-2及VEGF表达的结果进行重新赋值，阴性（-）为1、阳性（+）为 2，将DPC4分别与 bcl-2和VEGF进行Spearman相关分析。结果显示，DPC4与bcl-2（P<0.05）及 VEGF（P<0.05）均呈负相关关系。

3 讨论

大量研究表明，DPC4基因的缺失在胰腺癌、结直肠癌以及肺癌的发生发展中起着非常重要的作用[1～2]。本研究显示，65例非小细胞肺癌中DPC4的表达率为50.8%，与正常肺组织中的表达相比显著降低（77.8%），提示DPC4的低表达与非小细胞肺癌发生有关，此结果与Bai等[3]的研究结果相同。Gregory等[4]发现在前列腺癌中Smad4蛋白的表达与肿瘤的分级以及分期有关，分化越差的前列腺癌，其DPC4(Smad4)缺失率越高。Maitra等[5]通过免疫组织化学染色发法对不同分期的结直肠癌组织标记DPC4后，发现DPC4的功能缺失可能是在结直肠癌恶性进展的后期发生的，本研究显示DPC4与非小细胞肺癌组织的分级、分期明显相关，分化越差分期越高的肺癌组织，其DPC4的表达越低。同时，有淋巴结转移的肺癌组中DPC4阳性率显著低于无淋巴结转移的肺癌组,这些结果提示DPC4的失活可能发生在肿瘤进展的后期，属于晚期分子事件，并且可能参与了肿瘤浸润和转移的过程。这一结果与Barbera等[6]的报道相同。

DPC4是TGF-β家族的直接酶底物，它具有抑制细胞生长，抑制肿瘤转移等多种功能[7]。Kolek等[8]发现在HC11鼠乳腺上皮细胞中TGF-β1能够通过线粒体途径使bax活化和易位，从而诱导细胞的凋亡。同时研究发现，TGF-β在闭锁卵泡细胞[9]、人晶状体上皮细胞[10]、多能造血细胞[11]、人卵巢癌细胞[12]、结直肠癌细胞[13]中介导凋亡时会出现bcl-2水平的降低。bcl-2作为凋亡抑制蛋白对调节细胞凋亡具有关键性作用。但是DPC4与bcl-2之间到底是什么关系，到目前为止还不清楚。本研究结果显示，bcl-2与DPC4之间呈负相关关系，提示DPC4可能在TGF-β1介导的细胞凋亡过程中具有重要的作用，这与Ke等[14]的结论一致。TGFβ1在细胞凋亡的启动过程中具有重要的作用，而DPC4作为TGF-β2信号通路中的重要传导分子,其低表达会影响TGF2β促凋亡信号的传导,从而使凋亡细胞数降低。王春雷等[15]也证实DPC4能够促进细胞的凋亡。

血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)是一种高度特异的内皮细胞有丝分裂原，能够促进内皮细胞增殖，增加微血管通透性以及诱导血管生成，而且它在病理性血管生成过程中也具有中心调控作用，是肿瘤细胞分泌的血管形成因子中最重要的一种，也是目前已知的功能最多、作用最强的促血管生成因子之一[16]。它与多种肿瘤的发生、发展、转移和预后密切相关。有报道表明，TGF-β1具有活化血管生长因子的作用，其信号转导通路在微血管塑形中具有重要的作用[17]。Schwarte-Waldhoff等[18]在研究胰腺癌时发现，在体内DPC4的重新表达抑制了肿瘤的形成,但是TGF-β却没有这样的作用。同时，DPC4还可以通过减少VEGF的表达，增加血管形成抑制因子血小板反应蛋白21(TSP21)的表达来抑制血管的形成。本研究发现，DPC4与VEGF呈负相关关系，DPC4阳性的肺癌组织中VEGF阳性率明显低于DPC4阴性的肺癌组织，提示DPC4基因的缺失可能参与VEGF促进血管生成的机制。

综上所述，DPC4的失活可能与非小细胞肺癌的恶性进展如分期、分级及淋巴结转移有关，DPC4基因的缺失可能抑制肺癌细胞凋亡并促进其表达VEGF，从而使得肺癌逐渐向恶性进展并最终转移。

[1]Thiagalingam S，Lengauer C，Leach FS，et al.Evaluation of candidate tumour suppressor genes on chromosome 18 in colorectal cancers[J].Nat Genet，1996，13（3）:343～346.

[2]Nagatake M，Takagi Y，Osada H，et al.Somatic in vivo alterations of the DPC4 gene at 18q21 in human lung cancers[J].Cancer Res，1996，56（12）:2718～2720.

[3]Bai RY，Koester C，Ouyang T，et al.SMIF，a Smad4-interacting protein that functions as a co-activator in TGFbeta signalling[J].Nat Cell Biol，2002，4（3）:181～190.

[4]Sheehan GM，Kallakury BV，Sheehan CE，et al.Smad4 protein expression correlates with grade，stage，and DNA ploidy in prostatic adenocarcinomas[J].Hum Pathol，2005，36（11）:1204～1209.

[5]Maitra A，Molberg K，Albores-Saavedra J，et al.Loss of Dpc4 expression in colonic adenocarcinomas correlates with the presence of metastatic disease[J].Am J Pathol，2000，157（4）:1105～1111.

[6]Barbera VM，Martin M，Marinoso L，et al.The 18q21 region in colorectal and pancreatic cancer:independent loss of DCC and DPC4 expression[J].Biochim Biophys Acta，2000，150（2）:283～296.

[7]Derynck R.Zhang YE Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signalling[J].Nature，2003，425（6958）:577～584.

[8]Kolek O，Gajkowska B，Godlewski MM，et al.Co-localization of apoptosis-regulating proteins in mouse mammary epithelial HC11 cells exposed to TGF-beta1[J].Eur J Cell Biol，2003，82（6）:303～312.

[9]Foghi A，Teerds KJ，Van der Donk H，et al.Induction of apoptosis in thecal/interstitial cells:action of transforming growth factor（TGF）alpha plus TGF beta on bcl-2 and interleukin-1 beta-converting enzyme[J].J Endocrinol，1998，157（3）:489～494.

[10]Lee JH，Wan XH，Song J，et al.TGF-beta-induced apoptosis and reduction of Bcl-2 in human lens epithelial cells in vitro[J].Curr Eye Res，2002，25（3）:147～153.

[11]Francis JM，Heyworth CM，Spooncer E，et al.Transforming growth factor-beta 1 induces apoptosis independently of p53 and selectively reduces expression of Bcl-2 in multipotent hematopoietic cells[J].J Biol Chem，2000，275（50）:39137～39145.

[12]Lafon C，Mathieu C，Guerrin M，et al.Transforming growth factor beta 1-induced apoptosis in human ovarian carcinoma cells:protection by the antioxidant N-acetylcysteine and bcl-2[J].Cell Growth Differ，1996，7（8）:1095～1104.

[13]Hague A，Bracey TS，Hicks DJ，et al.Decreased levels of p26-Bcl-2，but not p30 phosphorylated Bcl-2，precede TGFbeta1-induced apoptosis in colorectal adenoma cells[J].Carcinogenesis，1998，19（9）:1691～1695.

[14]Ke Z，Zhang X，Ma L，et al.Deleted in pancreatic carcinoma locus 4/Smad4 participates in the regulation of apoptosis by affecting the Bcl-2/Bax balance in non-small cell lung cancer[J].Hum Pathol，2008，39（10）:1438～1445.

[15]王春雷，黄志雄，周宇新.TGF-β1对人肝癌细胞系凋亡的调控作用研究[J].肿瘤防治研究，2004，31（9）:526～528.

[16]Ferrara N.Vascular endothelial growth factor:basic science and clinical progress[J].Endocr Rev，2004，25（4）:581～611.

[17]Seo Y，Baba H，Fukuda T，et al.High expression of vascular endothelial growth factor is associated with liver metastasis and a poor prognosis for patients with ductal pancreatic adenocarcinoma[J].Cancer，2000，88（10）:2239～2245.

[18]Schwarte-Waldhoff I，Volpert OV，Bouck NP，et al.Smad4/DPC4-mediated tumor suppression through suppression of angiogenesis[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97（17）：9624～9629.

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1671-1246（2011）04-0078-03