库尔勒香梨"黑头病"病原菌的分离和初步鉴定

唐文娟，陈君慧，任雷厉，刘 琦，陈国刚，江 英

(石河子大学食品学院，新疆石河子832003)

库尔勒香梨"黑头病"病原菌的分离和初步鉴定

唐文娟，陈君慧，任雷厉，刘 琦，陈国刚，江 英*

(石河子大学食品学院，新疆石河子832003)

近年来，库尔勒香梨在贮藏中极易发生一种新型微生物病害——“黑头病”。本文对香梨黑头病病原菌分离、纯化和形态学进行初步鉴定。其结果表明，侵染黑头病香梨的病原菌有七株病原菌，分属于枝孢属(Cladosporium，简称C)、青霉属(Penicillium，简称P)、链格孢属(Alternaria，简称AL)和曲霉属(Aspergillus，简称AS)，同时通过致病性实验确定致病菌为真菌界(Fungi)半知菌亚门(Deuteromycotina)丝孢纲(Hyphomycetes)丝孢目(Hyphomycetales)暗色孢科(Dematiaceae)枝孢属(Cladosporium)。

库尔勒香梨，黑头病，致病性，初步鉴定

1 材料与方法

1.1 实验材料

库尔勒香梨 购于石河子农贸市场;致病库尔勒香梨 贮藏于库尔勒、阿克苏气调库和冷库的发病梨;马铃薯葡萄糖琼脂培养基［3］PDA 成分:马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，pH自然。

1.2 香梨黑头病病原菌的分离和纯化

依据柯赫氏法则从香梨的病健交界处切下病组织，移至PDA平板培养基上，于25℃下培养28～36h观察。再从初分离的菌落回接与未致病香梨进行致病性能的再确定，同时重复上述步骤得到初分离菌落用PDA平板进行稀释纯化培养，直到分离出菌落大小、形状、颜色、表面光滑湿润程度、菌丝生长快慢、菌丝形状、产孢情况、孢子颜色、形状等一致的若干菌株［4］。

1.3 香梨黑头病致病性的研究

表1 病原菌在PDA平板上的生长特性和显微特性

1.3.1 香梨黑头病致病菌的确定 将香梨用70%酒精将面朝上部的香梨梨体擦拭一遍，待干燥后用灭菌接种针刺破五个大小深度一致的小孔，然后用打孔器打取纯化后的单一菌株分别接至伤口，每一种菌株处理五个香梨放入无菌保鲜袋内，以穿刺后不接种进行对照。以25℃LRH保持在90%以上培养5～15d对其进行观察。如果症状与致病香梨症状一样，则确定该菌株是致病菌。

1.3.2 香梨黑头病致病菌不同接种量对香梨致病力的影响 用灭菌棉吸附70%的酒精对香梨表面擦洗消毒处理，再用无菌水洗净晾干后备用。在香梨萼部上用无菌接种针刺五个孔，其孔径直径约5mm，将不同浓度的菌悬液分别接种至伤口处，每个浓度重复三次，放入无菌保鲜袋内，以穿刺后无菌水接种进行对照。25℃恒温培养，LRH保持在90%以上培养5～15d后观察结果［4］。

1.4 致病菌的形态学鉴定［5-6］

1.4.1 三点培养 在平板底部以等边三角形标上三点。将接种针先在火焰上烧红灭菌，并在平板培养基的边缘冷却且蘸湿后伸入菌种管，用针尖沾取少量致病菌株孢子，以水平法把接种针上沾着的孢子以垂直的方向轻轻地点接到平板培养基表面预先做好标记的部位。最后将点接好的平板倒置于28℃恒温箱中培养，2d后观察其菌落特征。

1.4.2 载玻片培养 向灭菌培养皿内加入2～3mL无菌水，再放入一个灭菌U形玻璃管。取一载片沾取酒精在酒精灯上灼烧灭菌，立即放入培养皿中。用一根沾取酒精灼烧灭菌后沾取已融化的PDA培养基少许均匀涂布在玻片中央。用接种环挑取少量致病菌种的孢子接种于湿室内载玻片的培养基上。将其放在28℃恒温箱中培养，2d后观察。

2 结果与分析

2.1 香梨黑头病的主要症状

通过调查发现，该病在香梨入库4月后开始发病，且这种病害主要出现在宿萼果(“公梨”)上［2］。其主要症状:发病初期首先是果实萼部果皮出现黑褐色斑块，继而果实萼部果肉开始褐变软化，病斑处果皮皱缩、干硬，由果实萼部向果心扩大，最终病部呈现深褐色凹陷状。

2.2 致病香梨病原菌的分离和纯化

将黑头病香梨病原菌在PDA培养基上分离纯化，其结果见表1。从表1可知，分离、纯化得到七株病原菌。分属为枝孢属(Cladosporium，简称C)、青霉属(Penicillium，简称P)、链格孢属(Alternaria，简称AL)和曲霉属(Aspergillus，简称AS)。

2.3 香梨黑头病的致病性

2.3.1 香梨“黑头病”致病菌的确定 将分离纯化后的单一菌落接种至香梨萼部，在25℃生化培养箱中，LRH保持在90%以上培养4～15d，其结果表明，除菌株号FD-1(C)与香梨“黑头病”发病症状一致，其余六株的最终症状都为腐烂，因此，确定菌株号FD-1 (C)为香梨“黑头病”致病菌，七株菌株在香梨萼部发病症状与发病时间如表2所示。

2.3.2 香梨“黑头病”致病菌不同接种量对香梨致病力的影响 通过对香梨萼部进行“黑头病”致病菌不同接种量的接种实验，可以初步估计接种量对香梨致病力的影响，以及其发病所需时间，结果表明，接种量越大，发病所需时间越短，其致病菌的不同浓度接种于香梨中，发病情况如表3所示。

表2 香梨致病性测定情况

表4 香梨“黑头病”致病菌形态学特征

表3 致病菌不同浓度下的发病情况

2.4 香梨“黑头病”致病菌的鉴定

通过香梨“黑头病”致病性测定，得出导致香梨“黑头病”的致病菌为FD-1(C)，这种病原菌能导致香梨萼部出现“黑头病”症状，通过菌种的培养特性和显微特性分析，参照《真菌鉴定手册》［7］、《中国真菌志》［8］、《植物病原真菌学》［9］及《真菌的形态和分类》［10］对其进行鉴定，其菌落形态学特性如表4和图1。

根据香梨“黑头病”致病菌三点培养法和载玻片培养的形态学特性，可以初步确定菌株号FD-1(C)为真菌界(Fungi)半知菌亚门(Deuteromycotina)丝孢纲(Hyphomycetes)丝孢目(Hyphomycetales)暗色孢科(Dematiaceae)枝孢属(Cladosporium)。

3 结论

图1 致病菌形态图

本实验通过香梨“黑头病”病原菌的分离与纯化实验共得到七株病原菌，归属与四个属，分别为枝孢属(Cladosporium，简称C)、青霉属(Penicillium，简称P)、链格孢属(Alternaria，简称 AL)和曲霉属(Aspergillus，简称AS)。对七株病原菌致病性结果表明，引起香梨“黑头病”的主要致病菌为菌株号FD-1 (C)，根据菌落形态学特性初步确定FD-1(C)为真菌界(Fungi)半知菌亚门(Deuteromycotina)丝孢纲(Hyphomycetes)丝孢目(Hyphomycetales)暗色孢科(Dematiaceae)枝孢属(Cladosporium)。同时香梨“黑头病”致病菌不同接种量的结果表明，接种浓度越大，其发病时间越短。

［1］中国农业统计资料［M］.北京中国农业出版社，2007: 106-113.

［2］何子顺，牛建新，邵月霞.库尔勒香梨果实萼片脱落与宿存研究概况［J］.中国果菜，2006(2):10.

［3］方中达.植病研究方法［M］.北京中国农业出版社，1979:83.

［4］许玲，李学文，腾康宁.果蔬采后致病真菌的检测及其控制［J］.食品科学，2003，24(7):155-158.

［5］怎样观察与培养微生物［M］.北京师范大学出版社，1982: 54-55.

［6］陈国刚，毛晓英，陈昱，等.哈密瓜致病青霉的鉴定［J］.安徽农学通报，2006，12(3):102-103.

［7］魏景超.真菌鉴定手册［M］.上海科学技术出版社，1979:83.

［8］张中义.中国真菌志第十四卷:枝孢属、黑星孢属、梨孢属［M］.北京科学出版社，2005:7-10.

［9］陆家云.植物病原真菌学［M］.北京中国农业出版社，1979.

［10］戴芳澜.真菌的形态和分类［M］.北京科学出版社，1987 (3):94-95.

Isolation and identification the pathogens of blackhead disease of Kuerle pear

TANG Wen-juan，CHEN Jun-hui，REN Lei-li，LIU Qi，CHEN Guo-gang，JIANG Ying*
(Food College，Shihezi University，Shihezi 832003，China)

The“Blackhead disease”of pear is a new pear disease that produced in recent years.In the issue，separation，purification and morphology of pear’s“Blackhead disease”was preliminarily identified and seven species classified in the Cladosporium，Penicillium，Alternaria，Aspergillus genuses were obtained.The results got from the assay of pathogenicity were showed that Fungi Deuteromycotina Hyphomycetes Hyphomycetales Dematiaceae Cladosporium was major pathogen of root rot of Blackhead disease kuerle pear.

Kuerle pear;blackhead disease;pathogenicity;primary identification

TS255.1

A

1002-0306(2011)03-0366-04

库尔勒香梨是新疆传统的优质特色果品，新疆特定的地理气候条件赋予库尔勒香梨特殊的品质。据统计，2007年库尔勒香梨的产量约为44万t，每年出口量在3万t左右，平均出口离岸价远高于国内其它梨品种和大多数果品，显示出较强的市场竞争优势［1］。近年来，其生产规模逐年扩大，主要分布在库尔勒地区和阿克苏地区，在贮藏中受病害影响，大大降低了商品价值。“黑头病”(当地果农自称)是库尔勒香梨的新型病症。通过调查发现，阿克苏产区贮藏库群的发病率明显高于库尔勒地区，“黑头病”发病率高达2%～4%;而库尔勒地区“黑头病”发病率小于2%，并且这种病害在冷库及气调库均有发生。目前，香梨黑头病主要出现在宿萼果(“公梨”)上［2］。本文的研究为香梨黑头病的抗病性研究及防治措施奠定理论依据，从而降低黑头病发病率，提高香梨贮藏品质，促进香梨的产业发展。

2010-06-12 *通讯联系人

唐文娟(1985-)，女，在读硕士研究生，研究方向:农产品加工与贮藏。

石河子大学“自然科学与技术创新项目”(ZRKX2009YB)。