Omi/HtrA2和caspase-7在喉癌组织中的表达及相关性

李 珂，郝 艳，王建亭，马 敏 (长治市人民医院耳鼻咽喉科，长治 06000;长治医学院附属和平医院耳鼻咽喉科;首都医科大学附属北京朝阳医院耳鼻咽喉头颈外科;山西医科大学第二临床医学院耳鼻咽喉科;

*通讯作者，E-mail:tingjianwang@yahoo.com.cn)

恶性肿瘤的发生发展与细胞凋亡及增殖调节的失控密切相关，其中细胞凋亡在喉癌的发生、发展中起重要作用。促凋亡因子Omi/HtrA2对多种肿瘤细胞具有促凋亡效应，caspase-7是位于凋亡下游的重要效应蛋白，其在凋亡途径中发挥的重要作用早已引起人们的关注。本研究通过观察喉鳞状细胞癌中Omi/HtrA2和caspase-7蛋白的表达以及二者与临床病理特征相关性之间的关系，探讨其与喉癌发生、发展之间的关系，为喉癌诊断及治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2003－06～2009－12山西医科大学第二临床医学院和长治市人民医院耳鼻咽喉科收治的有完整临床资料的原发性喉鳞状细胞癌手术切除标本存档蜡块40例(喉癌组)，其中10例保留有相邻的安全缘以外的正常喉黏膜组织(对照组)。40例患者中，男31例，女9例，年龄43－76岁，平均(57.6 ±6.2)岁。按国际抗癌联合会(UICC)2002年TNM分期方案进行分期，其中Ⅰ期19例，Ⅱ期12例，Ⅲ期5例，Ⅳ期4例;声门上型癌24例，声门型11例，声门下型5例;高分化鳞癌28例，中分化鳞癌9例，低分化鳞癌3例;经病理证实有淋巴结转移7例，无淋巴结转移33例。所有病例术前均未行放、化疗，病理诊断均为喉鳞状细胞癌。

1.2 试剂与方法 Omi/HtrA2羊抗人单克隆抗体购自Santa-Cruz公司，caspase-7鼠抗人单克隆抗体购自Lab Vision公司，二步法免疫组化检测试剂盒PV-6000购自北京中杉金桥生物技术有限公司。所有标本均经中性甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，做4 μm厚连续切片备用。采用免疫组织化学技术二步法检测Omi/HtrA2和caspase-7表达，按照免疫组织化学试剂盒说明书进行操作。

1.3 结果判断 Omi/HtrA2、caspase-7蛋白阳性表达主要定位于细胞质，呈棕黄色。阴性对照以PBS液代替一抗，阳性对照为已知阳性切片。所有切片采用双盲法阅片，随机观察10个100倍视野并计数，每个视野至少计数100个细胞，取其平均值作为该病例的细胞阳性数，并据此对染色结果分级，阳性细胞数＜25%为阴性(－)，阳性细胞数25%－50%为阳性(+)，阳性细胞数＞50%为强阳性(++)。采用MIAS-2000图像分析系统(四川川大智胜公司)对染色结果进行定量分析，在100倍视野下每例标本选取5个阳性颗粒清晰，无非特异染色的视野，测定其目标平均灰度(G0)，视场平均灰度(GV)，面积密度(area ratio，AAR，即目标面积与视场面积的比值)按以下公式计算阳性单位(positive unit，PU)，取平均值。

2 结果

2.1 Omi/HtrA2和caspase-7的表达 Omi/HtrA2、caspase-7阳性表达均主要位于细胞质，呈棕黄色。Omi/HtrA2在喉鳞癌组织和正常喉黏膜组织中表达(图1)的阳性率分别为:72.5%(29/40)和20.0%(2/10)，平均阳性单位分别为 26.952±7.145 和10.395 ±6.978，差异有统计学意义(t=10.715，P＜0.05)。caspase-7 在喉鳞癌组织和正常喉黏膜组织中表达(图2)的阳性率分别为:67.5%(27/40)、30.0%(3/10)，平均阳性单位分别为 29.365 ±8.152和 9.362 ±4.234，差异有统计学意义(t=9.891，P＜0.05)。喉鳞癌组织中Omi/HtrA2和caspase-7表达具有相关性(r=0.332，P＜0.05)。

图1 喉癌组织中Omi/HtrA2蛋白表达(DAB，×400)Fig 1 Expression of Omi/HtrA2 protein in laryngeal squamous cell carcinoma(DAB，×400)

图2 喉癌组织中caspase-7蛋白表达(DAB，×400)Fig 2 Expression of Omi/HtrA2 protein in laryngeal squamous cell carcinoma(DAB，×400)

2.2 Omi/HtrA2和caspase-7表达与喉鳞癌临床病理学特征之间的关系 喉鳞癌组织中Omi/HtrA2和caspase-7表达与年龄、性别、肿瘤部位、TNM分期有无淋巴转移无相关;与癌组织病理学分级有关，见表1。

3 讨论

Omi/HtrA2是一种重要的促凋亡蛋白，是一种寡聚丝氨酸蛋白酶，由458个氨基酸组成，分子量为51 kD，编码基因位于染色体2q13(或2p12)。Omi/HtrA2作为新近发现的促凋亡因子，对多种肿瘤细胞具有促凋亡效应［1，2］。Omi/HtrA2 以三聚体的形式存在，Omi/HtrA2分子结构中含有氨基末端的Reaper样基序，丝氨酸蛋白酶功能区和C末端的PDZ结构域，此外，Omi/HtrA2还具有一个胰蛋白酶样催化结构域和线粒体定向序列［3－5］。Omi/HtrA2通过两种方式促进凋亡的发生:①结合X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)，通过caspase依赖的方式促凋亡;②凭借其丝氨酸蛋白酶活性以多条途径促凋亡。近来的研究发现Omi/HtrA2在胃癌和卵巢癌中高表达［6，7］，本研究发现 Omi/HtrA2 在喉鳞癌组织中高表达，在正常黏膜组织中弱表达，二者表达差异具有统计学意义，提示Omi/HtrA2在喉癌的发生、发展中起着一定作用。本研究中，在喉癌不同病理分级中，G1与G2+G3级比较，Omi/HtrA2表达差异有统计学意义，提示Omi/HtrA2过表达与喉癌的恶性程度有关，Omi/HtrA2可能参与了肿瘤的分化，从而影响肿瘤的发生、发展过程。本研究还显示，Omi/HtrA2阳性表达与喉癌患者的年龄、性别、临床分型(肿瘤部位)、临床TNM分期和淋巴结转移均无相关性，提示Omi/HtrA2过表达只是喉癌发生、发展过程中一个较早期的重要分子事件。

caspase-7属于半胱氨酸－天冬氨酸蛋白酶家族成员，是 caspase家族中重要成员，caspase-7是caspase级联反应中的下游分子之一，由303个氨基酸组成，分子量为35 kD，分布在胞质内和近膜结构上，是凋亡的最终效应分子之一。在细胞凋亡的发生发展过程中，目前发现信号转导通路有三条:一为caspase的细胞外通路(细胞膜途径);二为caspase的细胞内通路(线粒体途径);三为caspase的内质网通路。caspase-7是重要的效应蛋白，在三条凋亡途径中都起作用。本研究发现caspase-7在喉鳞癌组织中高表达，在正常黏膜组织中弱表达，二者表达差异具有统计学意义，表明caspase-7可能与喉癌的发生、发展有关。caspase-7在喉癌中的表达与喉癌患者的年龄、性别、临床分型(肿瘤部位)、临床TNM分期和淋巴结转移均无关，仅与组织分化有关，提示caspase-7可能通过调控喉癌细胞的凋亡影响喉癌的恶性程度。

表1 Omi/HtrA2和caspase-7表达与喉鳞癌临床病理学特征的关系Tab 1 Relationship between expression of Omi/HtrA2，caspase-7 and clinical pathological features in larynx cancer tissues

本研究对Omi/HtrA2和caspase-7在喉鳞癌组织中表达的相关性进行了分析，结果发现二者存在相关性，提示Omi/HtrA2可能通过多种作用方式裂解XIAP，从而解除了 XIAP对caspase-7的抑制作用，引起caspase-7在喉鳞癌组织中高表达。喉鳞癌组织中凋亡机制非常复杂，细胞凋亡减少是各种促凋亡因素和抑制凋亡因素共同作用的结果，也是导致恶性肿瘤发生、发展的重要原因，这也提示我们利用各种方法促进肿瘤细胞的凋亡可以达到治疗肿瘤的目的，利用Omi/HtrA2抑制凋亡抑制蛋白(IAPs)的作用来促进肿瘤细胞凋亡可为恶性肿瘤的治疗提供新思路。

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