褪黑素对急性坏死性胰腺炎合并肾损伤的保护作用及机制研究

杨慧莹 唐国都 苏娟 覃蒙斌 梁志海 钟卫一

褪黑素对急性坏死性胰腺炎合并肾损伤的保护作用及机制研究

杨慧莹 唐国都 苏娟 覃蒙斌 梁志海 钟卫一

急性肾功能衰竭是重症急性胰腺炎(SAP)患者早期病死的主要原因之一。因此研究其发病机制并寻求有效的防治措施具有重要的临床价值。Ghrelin是生长激素促分泌物受体的内源性配体，它在急性胰腺炎(AP)发生发展中具有抑制炎症的作用。本研究应用褪黑素干预急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠，观察肾组织Ghrelin和NF-κB p65表达及肾组织中氧化应激相关指标的变化，探讨褪黑素对肾损伤的作用机制。

一、材料与方法

1．实验动物及分组：健康雄性SD大鼠72只，清洁级，由广西医科大学实验动物中心提供，体重180～250 g。按完全随机法分为对照组、ANP组和褪黑素干预组，每组24只。采用腹腔注射6% L-Arg溶液(1.5 g/kg体重)3次、间隔1 h的方法制备ANP模型。褪黑素组于首次注射L-Arg前30 min腹腔内注射1%褪黑素50 μg/kg体重。对照组腹腔注射等容积生理盐水。末次腹腔内注射后6、12、24 h分批处死大鼠。观察大鼠腹腔内各脏器的变化，留取胰腺及肾组织，部分用10%甲醛固定，部分置-80℃保存，取血分离血清，-20℃保存。

2．胰腺和肾组织病理学检查：由同一病理科医师光镜下观察胰腺及肾组织病理变化，分别参考Kusske等[1]和雷文章等[2]标准评分。

3．肾组织Ghrelin、NF-κB p65 mRNA表达检测：采用Trizol提取肾组织总RNA， RT-PCR检测Ghrelin、NF-κB p65 mRNA表达。依据Gene Bank设计引物。NF-κB p65引物：5′-AGCTCAAGATCTGCCGAGTA-3′，5′-GATCTGCCCAGGTGGTAACAC-3′，扩增片段556 bp，扩增条件： 94℃ 5 min，94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 45 s，共35个循环，72℃ 10 min；Ghrelin引物：5′-GTGTCTTCAGCGACTATCT-3′，5′-CCTGTCAGTGGTTACTTGTT-3′，扩增片段362 bp，扩增条件95℃ 5 min，94℃ 1 min、56℃ 40 s、72℃ 40 s，共35个循环， 72℃ 10 min；内参β-actin引物：5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′， 5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，扩增片段150 bp。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后使用凝胶成像系统分析。……