草炭强化对油田陈化油泥生物修复工程效果的影响

卢桂兰，王世杰，郭观林，王翔，张玉，张朝，李发生*

1.中国环境科学研究院土壤污染与控制研究室，北京 100012

2.北京科技大学土木与环境工程学院，北京 100083

含油污泥具有产生量大、含油量高、重质组分多和难处理等特点，是石油生产过程中的主要污染物之一［1］。含油污泥减量化、无害化、资源化处理技术逐渐成为研究热点，目前主要的处理方式分为物理法、化学法和生物法。生物修复具有修复效果好、处理费用低，无二次污染、对环境影响小、公众接受度高等特点，被认为具有广阔的应用前景［2］。近年来，堆肥法成为陈化油泥最常用的生物修复技术［3］，堆肥法和土耕法修复原理相似，主要针对石油类污染引起的土壤理化性质变化，如堵塞土壤孔隙，土壤盐碱化、胶质化、板结化等特性，通过添加干草、割草、树叶、小麦秸秆和肥料等生物基质，提高堆肥效果［4-5］，对去除高浓度不稳定固体的有机复合物最有效。研究表明，添加外源石油降解菌和采取适当措施刺激土著微生物均能大幅降低土壤中的石油污染物浓度，改善土壤的理化性质，降低其生物毒性。叶小梅等研究了调理剂类型和添加量对污泥中石油类污染物生物降解的影响，研究发现添加木屑的效果最好，蛭石次之，稻草最差［6］。针对露天堆放了近30年的陈化油泥，笔者以草炭作为生物基质，采用土耕法进行生物修复试验，同时设置自然衰减为对照，分别测定了修复前后陈化油泥的理化性质，总石油烃(TPH)，石油组分，土壤微生物数量及群落变化等，以期为开发针对油田陈化油泥的修复技术提供理论依据和工作经验。

1 材料与方法

1.1 现场修复试验及样品处理

陈化油泥生物修复试验工程位于某采油厂联合站。该地区年均气温 11～14℃，年日照时数2300～2900 h，日照率52%～65%，年均降水量550～950 mm，多集中在6—9月;无霜期180～220 d，冬季140～150 d，夏季72～108 d，春秋各50～70 d，属于暖温带半湿润季风气候。该地区为渤海海岸浅滩地带，土壤类型以冲积型沙质土壤为主，土壤透气性能好［7］。经现场采样分析，表层土壤中TPH浓度约为200000 mg/kg，大大超过GB 4284—84《农用污泥中污染物控制标准》规定的土壤中矿物油浓度最高限值(3000 mg/kg)。

草炭强化生物修复陈化油泥试验设置3个试验区及1个自然衰减对照区(均为2.3 m×1.5 m×0.4 m)，油泥与草炭按质量比1∶1混合均匀，试验区概况如图1所示。试验区每个月深翻1次，分别在修复1，2，4，9，13，16 和 26 个月时采样分析。各试验区按多点混合法采样，每个混合样由10个样点组成。样品于4℃下保存。

样品预处理步骤。1)冷冻干燥:将采集的样品放入实验盘中，拣出其中的碎石、砂砾、植物残体，进行压碎、翻动、搅拌，使样品充分混合后置于-4℃冰箱中冷冻，再放入预冷好的干燥器中进行冷冻干燥(-57℃，300 Pa)24 h以上，使样品充分干燥;2)样品的选取:将冷冻干燥好的样品充分混合均匀，用碾钵磨细过筛(60目)，按四分法进行缩分。

图1 陈化油泥生物修复现场试验概况Fig.1 Overview of field research construction for bioremediation of oily sludge

1.2 草炭理化性质分析

草炭购自吉林省某公司，粉碎至10目左右，并按标准测试方法进行相关理化性质分析(表1)。

1.3 陈化油泥理化性质分析［8］

陈化油泥中TPH及石油组分的分析，以三氯甲烷为溶剂，通过快速溶剂萃取仪(美国戴安，ASE300)萃取，测定油泥中的总含油量。石油组分采用棒薄层火焰离子化法(TLC-FID)测定，棒薄层火焰离子化分析仪(日本，IATROSCAN MK6S)参数设定:空气和氢气流量分别为2000和60 mL/min，扫描速度为40 s/次。重金属浓度采用电感耦合等离子体质谱(Agilent Technologies ICP-MS 7500 Series)分析。

表1 草炭基本理化性质Table 1 Basic physicochemical properties of peat

陈化油泥的基本理化性质指标:pH用LY/T 1239—1999《森林土壤pH的测定》方法测定，离子交换量〔(CEC)，cmol(+)/kg〕用 LY/T 1243—1999《森林土壤阳离子交换量的测定》方法测定，全盐量用LY/T 1251—1999《森林土壤水溶性盐分分析》方法测定;陈化油泥的其他基本理化性质指标，如密度、有机质、有效氮、有效磷和有效钾等测试方法参照表1。

1.4 陈化油泥中微生物数量及生物多样性分析

陈化油泥中微生物数量采用逐级稀释平板计数法测定:准确称取10 g处理后的土样，放入装有90 mL无菌水并放有小玻璃珠的锥形瓶中(已灭菌)，用漩涡混合振荡器振荡2 min，使微生物细胞充分分散，静置20～30 s，制成稀释度为10-1的稀释菌液;用1 mL无菌吸管，吸取稀释度为10-1的稀释菌液1 mL，放入装有9 mL无菌水的试管(已灭菌)中，使菌液混合均匀，制成稀释度为10-2的稀释菌液;依此类推，连续稀释，制成8个稀释度的稀释菌液。取稀释度为 10-5，10-6，10-7和 10-8的稀释菌液各 0.1 mL，用涂布法均匀涂布在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上，倒置，37℃培养48 h。菌落计数方法:选取平均菌落数在30～300 CFU的平板，以菌落数乘以稀释倍数，计算出1 g土壤样品中含有的菌落数［9］。

生物多样性分析采用菌落Biolog ECO板(Biolog Inc，Hayward，CA)。测定菌落吸光度的分析方法:准确称取10 g处理后的土样于250 mL的锥形瓶中，加入100 mL 0.75%的生理盐水，将锥形瓶放入振荡器中充分振荡，转速100 r/min，振荡30 min，取土壤提取液10 mL，再用生理盐水稀释10倍。将稀释好的土壤提取液加样到Biolog ECO微平板上。每孔50 μL，每样1板(包括3个平行测定)，将Biolog ECO微平板置于25℃恒温箱中培养，24 h后用Biolog读数仪读数，将此次读数设为初始值，之后每隔24 h读数1次，连续读数7次。分别用菌落平均每孔颜色变化率(AWCD)值，Simpson指数和McIntosh指数表征微生物群体利用碳源能力的多样性［10-11］。

2 结果与讨论

2.1 修复前陈化油泥的理化性质及微生物数量

修复前陈化油泥的基本理化性质:油泥中TPH浓度为27%，其中非烃浓度为26%，沥青质浓度为10%;汞、铅、镉、铜、锌等重金属浓度均未超过GB 15618—1995《土壤环境质量标准》二级标准限值;微生物活菌数为50 CFU/g。

2.2 修复后对陈化油泥理化性质的影响

草炭强化生物修复能够改善陈化油泥的理化性质，有利于提高土著微生物的降解活性，从而提高石油烃类污染物的生物降解率。经过26个月处理，发现经陈化油泥草炭强化生物修复后，其理化性质得到显著改善:pH从8.7降至6.9，密度从2.7 g/cm3降至 1.2 g/cm3，有机质浓度从 1.2%增加为17.3%，全盐量从20.3 g/cm3降至7.3 g/kg，CEC增加约1倍(表2)。

表2 草炭强化生物修复前后陈化油泥的基本理化性质Table2 Physicochemical properties of aged oily sludge after 26 months'bioremediation with peat

研究表明，大多数土壤中微生物最适pH为中性范围，环境中的pH变化对微生物的影响很大，它通过引起细胞电荷的变化，影响代谢中酶的活性和细胞质膜的透性及稳定性，从而影响微生物对营养物质的吸收及石油烃生物降解速率［12-13］。通过添加草炭强化生物修复陈化油泥，主要是利用草炭中含有的大量有机酸分子、其具有的较大总表面积和较强的盐碱缓冲能力来调节陈化油泥的酸碱度，使其调整到适合微生物生长的范围［14］。王传远等认为油泥污染土壤中，通常含碳量较高，而微生物所需要的氮、磷等元素的相对缺乏，建议在进行石油修复中添加相应的营养元素来增强土壤微生物的活性［15-16］。笔者的研究中陈化油泥经草炭强化生物修复后土壤中有效态的营养元素显著提高，有效氮、有效磷和有效钾的浓度分别增加到184.0，3.0和146.0 mg/kg。草炭是盐碱及荒漠化治理的有效生物基质，在研究中草炭强化生物修复陈化油泥的作用还表现在3个方面:1)石油污染通常伴随盐碱产生，盐度太高对微生物生长具有显著的影响［17］。试验结果表明，草炭强化生物修复陈化油泥后盐浓度显著降低(表2)，有利于石油类污染物的微生物降解［18］。2)草炭结构中的官能团与土壤中胶体表面的官能团或化学键发生物理化学吸附作用，从而形成有机-无机复合体等团粒结构，有利于陈化油泥的孔隙度增加，密度下降［12］。3)采用草炭强化处理后，陈化油泥中有机质的浓度显著提高，其中一个重要原因是草炭本身含有大量的有机碳和腐殖酸［19］。

2.3 草炭强化生物修复对陈化油泥中TPH生物降解效果的影响

随降解时间的增加，自然衰减区和草炭强化生物修复区的陈化油泥中TPH浓度都呈现下降趋势，自然衰减区中TPH浓度从10.6 mg/g降至9.0 mg/g，草炭强化生物修复区中TPH浓度从12.4 mg/g降至7.6 mg/g。经过26个月降解，草炭强化生物修复区与自然衰减区中的陈化油泥TPH降解率存在明显差异:自然衰减区降解率为14.9%，草炭强化生物修复区的降解率为38.9%(图2)。

图2 草炭强化生物修复对陈化油泥中TPH生物降解率的影响Fig.2 Influence of peat on the biodegradation efficiency of TPH in oily sludge

自然衰减处理陈化油泥主要依靠土著微生物对石油烃类污染物的降解。宋玉芳等认为，污染物的降解在很大程度上依靠土著微生物的降解能力［20］。王震宇等研究证明，黄河三角洲盐渍化土壤中土著菌对石油烃具有较强的降解能力，原油生物降解率达到70.7%［21］。金文标等研究发现，油污土壤经90 d自然降解，其原油降解率达24.5%，并且添加原油降解菌和营养物，能够使石油生物降解效率提高20.7%［22］。试验发现，现场土著微生物对油泥自然衰减发挥重要作用。

通过深翻耕及添加草炭的方式，经过26个月现场降解试验，陈化油泥的TPH降解率达38.9%。由于陈化油泥黏着力强，严重限制了氧气的传输，形成厌氧或缺氧的环境，影响了石油的降解速率［23-24］。通过翻耕和添加草炭等，改善了土壤理化性质，增加了土壤透气性和单位体积内的供氧量，促进了微生物的活性，Embar等通过添加蛭石的方法提高土壤的通透性，使石油的降解率提高了近20%［25］。研究发现，添加草炭能显著促进陈化油泥的降解，其主要原因有3个方面:1)草炭对石油污染物具有一定的吸附作用［26-27］;2)陈化油泥中添加草炭可显著增加有机质浓度(表2)，已有研究结果表明，通过添加稻草、有机肥、玉米芯、树皮碎片等生物基质，土壤中石油降解率显著增加［28-30］;3)草炭中的腐殖酸具有表面活性剂增溶作用，能促进石油烃类污染物的解吸附，并提高微生物对土壤中残留石油的降解［31］。

2.4 草炭强化生物修复对陈化油泥中石油组分降解效果的影响

研究表明，经过自然衰减和草炭强化生物修复处理的陈化油泥，其残留石油烃组分相对浓度变化趋势一致:饱和烃、芳香烃、沥青质均呈下降趋势，非烃呈上升趋势，生物降解率表现为饱和烃＞芳香烃＞沥青质＞非烃(图3)，其他研究结果也表明，陈化油泥中石油组分的生物降解呈现相似的规律［13，32-33］。由于原油中含有大量的 S，N 和 O 等非烃类化合物(主要为硫醇、噻吩、卟啉、喹啉、环烷酸、脂肪酸及酚、酮类化合物)，这些物质通常不易分解，因此降解过程中非烃类污染物的相对密度逐渐增加［34］。此外，非烃类物质使石油黏稠，并造成土壤板结，透气性差，导致微生物、植物生长处于厌氧环境，常需辅以其他修复方法(化学萃取法、焚烧法、物理破碎等)处理陈化油泥，提高生物修复效率，降低对土壤的危害。如图3所示，在自然衰减与草炭强化降解的陈化油泥样品中，沥青质浓度明显减小，说明在一定条件下沥青质也能部分被生物降解［35］，通过选择适合的微生物菌株利用胶质和沥青质作为唯一碳源［36-37］。

2.5 草炭强化生物修复对微生物数量和生物多样性的影响

在生物修复开始时(降解时间为0月)，草炭强化生物修复区的陈化油泥中微生物数量比自然衰减区的高2个数量级，说明添加草炭能迅速增加陈化油泥中的微生物数量，因为草炭中含有大量的外源性微生物菌群。研究表明，微生物降解石油烃污染物的过程中，微生物数量是影响降解速率的重要因素［9］。对草炭强化生物修复区26个月中的5次微生物数量监测结果见表3。

图3 草炭强化生物降解对陈化油泥中石油烃组分的影响Fig.3 Influence of peat on change of hydrocarbons components in bioremediation of aged oily sludge

表3 草炭强化生物修复区微生物数量监测结果Table 3 Monitoring results of microorganisms quantity in peat-enhanced bioremediation region

由表3可见，微生物数量随时间的增加呈下降趋势，其下降原因有待进一步研究，初步推测是石油的毒害作用及土壤中有效态营养元素浓度的影响［38-42］。Kaufmann等研究发现，在长期的石油污染土壤中，对环境敏感的微生物种群类型和数量呈下降趋势，逐渐被具有石油降解能力的微生物所代替［43-45］，因此只有适应高含油量的微生物才能存活。环境介质中烃类污染物生物降解代谢，往往是不同种属微生物共同作用的结果［46］。AWCD值，Simpson指数和McIntosh指数是反映微生物群落整体活性的有效指数，从群落Biolog多样性指数中可以得出:生物修复开始时(降解时间为0月)，草炭强化生物修复处理的AWCD值，Simpson指数和McIntosh指数均大于自然衰减对照(表4)，表明草炭的添加能够提高陈化油泥中微生物的多样性，证实了添加草炭后土壤中的微生物数量较纯油泥污染显著增加;但陈化油泥经过了26个月的生物降解，草炭强化生物修复处理的AWCD值，Simpson指数和McIntosh指数值均有所减小，说明其微生物多样性的减少，也证实了石油污染对微生物种群的选择性影响。该现象的产生，可能与草炭能够产生腐殖酸和提供N，P等营养元素有关。研究表明，在一定时期内营养物质浓度是影响微生物数量及污染物降解率的主要因素［47］，添加N和P营养能够显著提高石油降解菌数量和活性［48］，施用腐殖酸肥料可促进土壤微生物的繁殖及酶活性的增加［49］。

表4 草炭强化生物修复对陈化油泥中微生物数量和微生物多样性的影响Table 4 Influence of peat on the microbial quantity and biodiversity of aged oily sludge

3 结论

(1)草炭强化生物修复对陈化油泥具有较好的修复效果，经过26个月的降解过程，TPH降解率达到38.9%，较自然衰减的降解率(14.9%)提高了24%。其中对石油组分中的饱和烃、芳香烃的降解率较大，对沥青质也具有一定的降解效果。

(2)草炭强化生物修复对陈化油泥的理化性质具有明显改善作用，能有效调节陈化油泥盐碱浓度(从20.3 g/kg降至7.3 g/kg)和酸碱度(pH从8.7降至6.9)，提高了土壤的有机质浓度(从1.2%增加为17.3%)，CEC增加约1倍，有效态营养元素浓度显著提高，微生物生长环境的改善，提高了石油烃类污染物的降解效率。

(3)与自然衰减对照相比，添加草炭后，陈化油泥中微生物数量(增加2个数量级)、活性和微生物多样性明显增加，在陈化油泥生物修复过程中补充草炭等生物基质，可以作为提高工程修复效果的有效手段。

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