实时荧光定量聚合酶链反应在肺结核诊断中的应用

毛文捷，邹盛华，张丽水，黄明翔，戴腊梅（福建省福州市肺科医院 350008）

实时荧光定量聚合酶链反应（FQ－PCR）技术于1996年由美国应用生物（Applied Biosystems）公司推出，较常规PCR（end－point PCR）不同，可在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。本院于2007年从美国Applied Biosystems公司引进该技术，应用于结核病的临床诊断。本研究对189例临床诊断肺结核患者的痰液进行FQ－PCR检测、BACTEC 960培养和涂片抗酸染色，并对结果进行对比分析，探讨FQ－PCR在肺结核诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取本院2010年1月至2010年3月住院的经细菌学确诊的肺结核患者189例，其中男102例，女87例，年龄18～75岁，平均33.8岁。其他肺部疾病患者94例，其中肺炎19例，非结核分枝杆菌肺病20例，支气管扩张24例，肺癌31例。另取门诊健康体检者20例作为对照组，其中男女各10例，年龄20～55岁。

1.2 仪器与试剂 美国应用生物（Applied Biosystems）公司生产的ABI7300荧光定量扩增仪，结核分枝杆菌核酸扩增PCR荧光检测试剂盒为中山大学达安基因股份有限公司生产，美国BD公司BACTEC 960全自动分枝杆菌检测仪及配套试剂，奥林巴斯显微镜，抗酸染色液（自制）。质控菌株：结核分枝杆菌（ATCC27294）。

1.3 方法 189例肺结核患者采集早晨痰液标本3份，分别进行FQ－PCR检测、涂片抗酸染色镜检及BACTEC 960培养。其他肺部疾病患者94例及健康体检者20例采集晨痰标本1份进行A组实验。

1.3.1 PCR检测 （1）痰液中加入4倍体积的4%NaOH，摇匀，室温下放置30min左右液化，取1.0 mL至离心管中，再加入0.5 mL 4%NaOH，室温放置10min后15 000 r／min离心5min。去上清液，沉淀加无菌生理盐水1 mL打匀，15 000 r／min离心5min，再重复一次，沉淀加50μL DNA提取液，置沸水浴10min。……