氮磷比对PEI介导BMP-7基因转染骨髓间充质干细胞的影响

嵇晓利，刘劲松，徐海红，刘传通，张大风，麻健丰

（温州医学院附属口腔医院 口腔修复科，浙江 温州 325027）

近年来，基因治疗在骨组织工程中受到越来越多的关注。基因治疗的关键在于如何借助载体将外源基因准确有效地导入靶细胞。基因载体主要分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体虽然转染效率高，但存在自身难以克服的局限性，如能诱导宿主免疫反应及潜在的致癌性，制备复杂等。而非病毒载体具有安全性高，免疫原性低，易于组装，体内可反复应用等优势，使其在组织工程中应用逐渐增多。阳离子聚合物如聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）、多聚赖氨酸、阳离子脂质体等是目前应用最多的非病毒载体类型。1995年Boussif等[1]首次使用PEI作为非病毒载体将DNA有效地转移到神经元细胞。随后的研究发现，PEI可缩合质粒DNA，具有特殊的“质子海绵效应”，不需溶酶体抑制剂即可转染细胞。PEI被认为是目前最为有效的非病毒载体之一[2-3]。PEI介导的基因转染效率受多方面因素影响，其中N/P值（PEI与DNA的氮磷比，即PEI的氨基与DNA的磷酸基团的摩尔比例）对其影响最大[4]。因此，本实验考察PEI与含骨形态发生蛋白-7基因（bone morphogenetic protein-7，BMP-7）质粒形成的纳米复合物N/P值对复合物转染骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，MSC）表达BMP-7以及细胞毒性的影响，从而筛选出较优的转染条件，为PEI作为非病毒载体在骨组织工程中的应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料及仪器 pcDNA3.1-BMP-7质粒（由四川大学蒋嫒医师惠赠）；大肠杆菌；出生1周SD大鼠；PEI分子量为25 kD，分枝型（Sigma，美国）；质粒大量抽提试剂盒（Qiagen公司，德国）；ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程公司）；粒径/Zeta电位测定仪（Malvern，英国）。

1.2 PEI/DNA复合物的制备 BMP-7质粒转化大肠杆菌并按照质粒DNA的提取试剂盒操作手册进行pcDNA3.1-BMP-7质粒的大量扩增。精密称取适量PEI溶于PBS（pH 7.4，150 mmol/L），制得1 mg/mL的储备液。将储备液稀释成0.1 mg/mL的PEI试液，并与质粒溶液（0.1 mg/mL）按一定的N/P值（0.5、1、3、5、7、10、20和30）轻摇混合，静止30 min备用。

1.3 PEI/DNA复合物粒径及Zeta电位测定 采用粒径/Zeta电位测定仪测定已经制备的纳米复合物的粒径以及Zeta电位值。

1.4 DNA酶（DNase）保护实验 DNase保护实验用于检测复合物抵御DNase消化的能力。按不同的N/P值制备PEI/DNA复合物，每份20μL，分装于离心管。每管加入4单位的DNA酶1（DNase1）或4μL PBS（对照），37 ℃反应15 min（1单位DNasel的活性指在37 ℃，用时10 min完全消化1 mg DNA所需要的酶量）。反应后，马上加入100 mmol EDTA，室温静置10 min以灭活酶活性。进一步把每份样品加入肝素钠溶液（10μL，10μg/mL）或H2O，室温下静置2 h，以释放DNA。重复检测3次，最后通过凝胶电泳分析PEI对DNA的保护效果。

1.5 细胞毒性实验 将第三代MSC细胞接种于96孔板，密度5000个/孔，每孔0.2 mL a-MEM培养基，随后把96孔板置于37 ℃、5% CO2条件下的细胞培养箱中培育24 h使细胞重新贴壁生长。然后将96孔板中的培养基移除，每孔加入100μL无血清培养基，除了其中3个对照孔外，其余实验孔加入浓度为7μg/mL的不同N/P值（0.5、1、3、5、7、10、20和30）的PEI/DNA复合物，每N/P值实验组5个实验孔。再将96孔板放回细胞培养箱中孵育4 h。吸取培养液每孔加入100μL内含5μg/mL MTT的a-MEM，37 ℃温育4 h。翻板法弃去液体。每孔加入100μL二甲基亚砜，震荡10 min，立即于微孔板阅读器上，在490 nm波长处读取吸光度值（optical density，OD）均值。以阴性对照组OD值为100%细胞增殖率，计算各组细胞相对增殖率（relative growth rate，RGR）。RGR=（各浓度组OD均值/阴性对照组OD均值）×100%。

1.6 转染效率测定 取第三代的MSCs，以5×103/mL的浓度接种于96孔板中，每孔液量1 mL。待细胞贴壁铺满培养板达60%～70%后，分别加入浓度为7 mg/mL的不同N/P值（0.5、1、3、5、7、10、20和30）PEI/DNA复合物，每N/P值实验组5个实验孔，继续培养24 h后，去除24孔板中的培养基，PBS冲洗孔板，加入细胞裂解液，取裂解后样品离心，取上清液，4 ℃保存。按照ELISA试剂盒的步骤测定BMP-7的含量。

1.7 统计学处理方法 采用SPSS11.0统计软件进行单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PEI/DNA复合物的粒径和Zeta电位 复合物的N/P值从0.5上升到3时，粒径随PEI的增加而减小（P<0.05）。而N/P值在3～30的范围时，复合物的粒径相对较稳定（P>0.05）。N/P值从0.5上升到5时，复合物的Zeta电位从2.10 mV升至31.85 mV。N/P值在5～30范围时，Zeta电位在30～40 mV波动（见表1）。

2.2 复合物抵御DNase消化的能力 图1为加入DNase后电泳结果。在N/P值低于3时，泳道中正极方向完全没有DNA的亮色条带出现，说明DNA已经被DNase完全分解；当N/P值在3至30时，随着PEI的增加，DNA亮色条带出现并逐渐增强，说明PEI对DNA的保护功能增强。

表1 不同N/P比形成的PEI/DNA纳米颗粒的平均直径、Zeta电位、MSC的BMP-7表达量

图1 DNase 1处理后凝胶电泳（电泳图上方为N/P值）

2.3 复合物对MSC的转染效率及毒性 N/P值对MSC活力的影响见图2。当N/P值越小时，即DNA比例越高时，对MSC毒性越小。当N/P值在0.5～10范围内，细胞活力有下降，但相对较小（P>0.05）。当N/P值高于10时，细胞活力下降明显，细胞毒性增大（P<0.05）。不同N/P值的复合物转染MSC的BMP-7蛋白质表达量见表1。其转染效率在0.5～7范围时，随着N/P值的增加，MSC的BMP-7表达量随之增加（P<0.05），在N/P=7时达到峰值，其后随着N/P值增加，BMP-7表达量反而下降（P<0.05）。

图2 N/P值对MSC活力的影响

3 讨论

BMP-7是转化生长因子超家族的一员，其基因位于人的第20号染色体，分子质量约1.6 kb。BMP-7在单独存在的情况下即可诱导软骨和骨组织的形成。实验证明，重组人BMP-7在体内和体外都显示了高效的骨诱导活性，可使多种实验动物的骨缺损愈合[5-6]。它可促进成骨细胞增殖和碱性磷酸酶的表达，促进MSC增殖，并促使其向成骨细胞分化和诱导体外成骨，被认为具有较强的骨诱导能力，已广泛用于骨组织工程学[7]。因此，本实验选择含BMP-7基因的质粒pcDNA3.1作为缓释基因，为今后基因缓释组织工程支架材料方面的应用提供实验基础。

分枝型PEI及其衍生物类基因传递系统的转基因转染效率和它们的毒性取决于其分子量、阳离子电荷密度和它们的缓冲能力[8-9]，分枝型PEI的基因转染效率随分子量增大而提高，但分子量大时其细胞毒性也随之增加，25 kD分枝型PEI是其转染效率和细胞毒性的最佳平衡点，是迄今发现的转染效率最高的非病毒载体之一[10]。本实验选此种材料作为基因载体。

PEI/DNA复合物的表面电荷、粒径是其体内转染效率的重要影响因素。复合物粒径大小与PEI的分子量有关，分子量大对DNA压缩能力强，粒径小。本实验显示PEI与含BMP-7基因的质粒形成的纳米颗粒直径在80～200 nm，这与大多数文献[11-12]用于体内外转染的复合物的粒径范围相似。随着复合物N/P值的增加，粒径有减小的趋势，这是因为随着PEI量的增加，其对DNA的压缩能力增强，有利于细胞的吞噬及体内逃脱。PEI/DNA复合物表面带有的正电荷是与表面带有负电荷的细胞膜结合进而诱导细胞内吞或胞饮的前提条件，但Zeta电位过高的复合物不仅毒性大，而且由于容易结合蛋白质（主要是白蛋白）或红细胞，复合物在体内较快清除。本实验结果显示当复合物的N/P值范围在5～30时，Zeta电位相对稳定，有利于复合物细胞膜结合继而进入胞内，对BMP-7的蛋白质表达量的检测也证实最佳转染效率在此N/P值范围内出现。转染效率是检测基因治疗效果最重要的指标，本实验通过检测BMP-7的蛋白质表达量来测定[13]。转染复合物N/P值对其转染效率有极大的影响，在生理pH条件下PEI中的1/5～1/6胺基被质子化[14]，并且这些带正电荷的胺基将与DNA中的负电荷结合形成纳米胶体颗粒。当N/P高时，即复合物的净的正电荷增加时，复合物与细胞的相互作用加强并且增加了细胞与细胞核的吸收能力[15-16]。从结果可以看出，N/P值对转染效率的影响呈现双向效应。在N/P值低于7时，转染效率随N/P值增加而增加。这是由于随着PEI的增加，DNA被充分压缩包装，更有利于细胞跨越细胞膜障碍。而过高的N/P值反而会导致转染效率的下降，可能与DNA过度压缩颗粒过小有关。

PEI的细胞毒性可能是由于其对细胞膜有较高的亲合黏附，并且能穿透细胞壁。PEI在细胞膜上可形成2～6 mm的团状物，低分子量的PEI形成仅10～50 nm的小聚集物，但当PEI与DNA结合后，毒性作用减弱[17]，本研究也证实了这一点。在实验结果中发现单纯PEI的毒性远远大于PEI/DNA复合物的毒性。其可能的原因是含阳离子的聚合物与含有阴离子的DNA结合后，PEI的阳离子与细胞膜的相互作用减弱而细胞产生损伤减少。从实验结果来看，当N/P值大于10 时，细胞的毒性急剧增加，与其他研究[18]结果相近。

通过以上一系列检测，我们认为应尽量选择对细胞毒性小而转染效率高的参数。因此在组织工程应用中，N/P值为7～10的PEI/DNA复合物可获得对骨髓间充质干细胞较好的转染效果。

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