两种生物酶对马尾松硫酸盐浆辅助漂白性质的影响

张利萍 ，高 慧 ，关 莹 ，黄 勃

两种生物酶对马尾松硫酸盐浆辅助漂白性质的影响

张利萍1，高 慧1，关 莹2，黄 勃1

（1.安徽农业大学 林学与园林学院，安徽 合肥 230036；2.北京林业大学 材料科学与技术学院，北京 100083）

以马尾松KP为试样，通过对木聚糖酶和漆酶辅助漂白系统中几个重要影响因子的试验，摸索各因子对酶辅助马尾松KP浆漂白性质的影响。结果表明，ABTS作为漆酶漂白介体时，用量在0～10 mg·g-1范围内，纸浆卡伯值随其用量增加而降低；介体吐温80质量分数在1%时，卡伯值最低。木聚糖酶用量为80 U•mg-1，漆酶为20 U•g-1时，处理效果最好。木聚糖酶在60℃时，漆酶介体在30℃时，卡伯值最低。木聚糖酶和漆酶介体处理时间为150 min和90 min时，浆料卡伯值低，黏度下降较少。木聚糖酶和漆酶介体系统pH值为6.0和5.0时，马尾松浆卡伯值下降了2.76和3.40。纸浆质量分数为10%时，木聚糖酶和漆酶介体处理效果好。

马尾松KP浆；木聚糖酶；漆酶介体；卡伯值；特性黏度

马尾松纤维长、密度大，生长迅速，全树综合利用率高，是我国南方分布最广的工业用材树种，特别是作为纸浆材的原料树种，发展潜力大[1-2]。随着科技发展和环保要求，需要从源头上减少纸浆漂白带来的污染。因此，生物酶漂白、无氯漂白、氧漂等环保型漂白技术受到工业生产的青睐，不少学者在这方面作了的研究[3-6]。但是，关于马尾松KP生物漂白的研究较少，主要有詹怀宇[7]、吴淑芳[8]分别研究了木聚糖酶和木聚糖酶、漆酶混合系统对马尾松KP浆漂白性能的研究。目前，漆酶和木聚糖酶在纤维材料的预处理、纤维改性、辅助制浆和漂白、废纸脱墨、废水净化、脱色等方面表现良好，在一定程度上能够降低能源消耗，减少化学药品使用，提升纤维或纸张性能。

木聚糖酶是一类降解木聚糖分子的复杂酶系，组成比较复杂，包括内切β-1，4-木聚糖酶、β-D-木糖苷酶、A-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、酚酸酯酶等。它实际上是一种半纤维素酶，可以分解Lcc复合体分子中的半纤维素部分[9]。

漆酶(EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，是蓝色多铜氧化酶家族（MCO）中最主要的成员，是一种能够降解木素的“环保型”催化剂。由于其氧化还原电势比较低（0.5～0.8 V），因此，单纯采用漆酶进行浆料的漂白，不会对浆料的卡伯值和硬度起到明显的改变。后经研究者发现[10]，漆酶需要在一些介体辅助漂白系统中（称为LMS系统）才能达到氧化降解木素的目的。

由于生物酶价格比较昂贵，在工业化生产过程中，只有适应范围广、价格相对低廉的生物酶才有应用前景。笔者针对木聚糖酶和漆酶在辅助漂白过程中酶用量、处理时间、温度、pH值以及纸浆质量分数这几个重要因子进行试验，筛选出经济适用型漂白方案，为漂白行业提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试样制取

马尾松采集自安徽省滁州市沙河集林场。按照国家标准GB/T2677.1-1993锯解，平衡含水率后，进行蒸煮试验，制备出马尾松KP原浆试样备用。经测定，马尾松原浆（未漂浆）卡伯值为22.63，特性黏度为 965 mL·g-1。

木聚糖酶：购于合肥市某生物公司，活性≥60 U·mg-1。漆酶：通过上海生物科技有限公司订购，活性≥ 20 U·mg-1。

1.2 试验方法

漆酶、木聚糖酶处理马尾松KP浆方法：将浆料与酶液密封聚乙烯塑料袋内，通过恒温水浴锅保持温度。将每份10 g绝干浆和酶液放入塑料袋中 混 合 均 匀， 用 2 mol•L-1HCL 和 1 mol·L-1的NaOH调节pH值，每隔5 min轻揉塑料袋，使浆与酶混合均匀，达规定时间后取出洗净供分析用。

1.2.1 介体对漆酶预处理马尾松浆漂白性质的影响

ABTS和吐温80作为介体，在漆酶用量10 U•g-1，温度 25℃，处理时间 60 min，pH 值为7.0，纸浆质量分数8%的条件下，分别测定纸浆性质变化。

1.2.2 两种酶用量对马尾松浆漂白性质的影响

在温度25℃，处理时间60 min，pH值为7.0，纸浆质量分数8%时，分别测定纸浆性质变化。

1.2.3 助漂系统温度对酶预处理马尾松KP浆性质的影响

在木聚糖酶用量50 U•mg-1时，漆酶（介体-吐温80用量1%）用量10 U•g-1（介体吐温80用量1%），时间60 min，pH值7.0，纸浆质量分数为8%的条件下，分别测定纸浆性质变化。

1.2.4 助漂系统时间对酶预处理马尾松KP浆性质的影响

在木聚糖酶用量50 U•mg-1时，漆酶（介体-吐温80用量1%）用量10 U•g-1，温度25℃，pH值7.0，纸浆质量分数8%的条件下，分别测定纸浆性质变化。

1.2.5 助漂系统pH值对酶预处理马尾松KP浆性质的影响

木聚糖酶用量50 U•mg-1时，漆酶（介体-吐温80用量1%）用量10 U•g-1，温度25℃，时间60 min，纸浆质量分数8%的条件下，分别测定纸浆性质变化。

1.2.6 助漂系统纸浆质量分数对酶预处理马尾松KP浆性质的影响

木聚糖酶用量50 U•mg-1时，漆酶（介体-吐温80用量1%）用量10 U•g-1，温度25℃，pH值7.0，时间60 min条件下，分别测定纸浆性质变化。

1.3 木聚糖酶活力测定方法

取1 mL1%木聚糖溶液，加入1.0 mL醋酸-醋酸钠缓冲液（pH值为4.8），置于50℃水浴30 min，之后加入3.0 mLDNS（3，5-二硝基水杨酸）溶液终止反应，立即煮沸10 min，冷却定容至25 mL，测定其在550 nm处的吸光度值。在上述条件下，1g固体酶粉水解1 min生成相当于1 μmol木糖的量为1个酶活力单位，以U·mg-1表示[11]。

1.4 漆酶活力测定方法

取0.1 mL酶液，2.7 mL 0.1mol·L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH值为3.5），再加入0.2 mL 50 mmol·L-1ABTS以启动反应。采用北京普析SPC紫外分光光度计，在25℃下，测定OD420 nm下反应前5 min内的吸光值变化。1 mL酶液每分钟催化底物（ABTS）引起吸光值增加0.001所需酶量为一个酶活力单位[12-13]。

1.5 纸浆硬度测定方法

按照GB/T1546-2004和GB/T1548-2004进行[14]。

2 结果与分析

在生物酶预处理过程中，酶用量、处理过程的温度、时间pH值、浆料的浓度（相对于绝干浆的质量分数）等因子都会对浆料的性质产生影响，这些因子不是单一作用的，而是互相影响和促进。

2.1 LMS系统对马尾松KP浆预处理后性质的影响

漆酶与木聚糖酶不同，由于其电位较低，需要在介体辅助下才能更好的发挥漂白效果。已报道的有效介体主要有2，2联氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）、吐温、盐酸异丙嗪（PTC）、吩噻嗪（PT）、1-羟基苯并三唑（HBT）、N-羟基-N-乙酰基苯胺（NHA），以及由NHA衍生的一些化合物等[15-16]。

图1 ABTS用量对漆酶马尾松KP浆卡伯值的影响Fig. 1 Effects of ABTS dosage on kappa number

图2 吐温80用量对漆酶马尾松KP浆卡伯值的影响Fig. 2 Effects of tween 80 dosage on kappa number

由图1可以看出，在ABTS用量为0.5～10 mg•g-1，随着ABTS用量的增加，卡伯值呈现递减趋势。ABTS 用量为 0.5 mg•g-1和 10 mg•g-1时，卡伯值分别为21.26和19.66，与未漂浆相比，分别下降了1.37和2.97。

由图2可以看出，随着吐温80用量的增加，卡伯值呈现先下降后上升的趋势。吐温80用量为1%时，卡伯值最低为20.68，比用量0.2%和5%时，分别下降了1.76和0.76，比未漂浆下降了1.95。

由图3可以看出，ABTS用量为0.5 mg•g-1、1 mg•g-1、10 mg•g-1时，特性黏度分别为 960 mg•g-1、958 mg•g-1、944 mg•g-1，分别比未漂浆降低了 5 mg•g-1、7 mg•g-1、21 mg•g-1。

由图4可以看出，吐温80用量为2%和5%时，特性黏度为 955 ml•g-1和 958 ml•g-1。吐温 80 用量为1%时，特性黏度为960ml•g-1，比未漂浆降低了 5 ml•g-1。

图3 ABTS用量对漆酶马尾松KP浆特性黏度的影响Fig. 3 Effects of ABTS dosage on viscosity

图4 吐温80用量对漆酶马尾松KP浆特性黏度的影响Fig. 4 Effects of tween 80 dosage on viscosity

对漂白而言，降低卡伯值，有利于提升白度；减少黏度降低，有利于保持纤维长度。卡伯值和特性黏度是衡量漂白性质的重要指标。综合来看，ABTS用量为1 mg•g-1为宜，吐温80用量为1%最佳。由于ABTS价格远远高于吐温80，为了节约成本，适应工业化生产，笔者拟选取1%吐温80作为漆酶漂白系统的介体（下文所指漆酶为漆酶+1%吐温系统）。

2.2 酶用量对马尾松KP浆预处理后性质的影响

酶用量过大，易造成浪费，增加成本；酶用量过低，不能达到漂白的效果。因此，在进行酶的预漂过程中，要通过试验来确定一个合适的酶用量。

图5 木聚糖酶用量对马尾松浆卡伯值的影响Fig. 5 Effects of xylanase doage on kappa number

图6 漆酶介体用量对马尾松浆卡伯值的影响Fig. 6 Effects of laccase dosage on kappa number

由图5和6可以看出，随着酶用量的增加，卡伯值呈现下降的趋势，并逐步趋于平缓。这是因为，酶用量较低时，它可以充分接触到木质素，降解效率就高，而随着酶用量的增加，到达一定程度后，木质素降解的残余物对浆料木质素形成“包裹”态势，阻碍了酶的降解效率。由图5可以看出，在木聚糖酶用量为80 U•mg-1时，卡伯值为19.05，与未漂浆相比，下降了3.58。由图6可以看出，漆酶用量为20 U•g-1时，卡伯值最低为18.49，比用量10 U•g-1时，下降了2.00，比未漂浆下降了4.14。

图7 木聚糖酶用量对马尾松浆特性黏度的影响Fig. 7 Effects of xylanase dosage on viscosity

图8 漆酶介体用量对马尾松浆特性黏度的影响Fig. 8 Effects of laccase dosage on viscosity

由图7和8可以看出，随着酶用量的增加，特性黏度值逐渐降低。木聚糖酶用量在60～80 U•mg-1时，浆料特性黏度值相近，变化缓和，用量80 U•mg-1时，其值为90 mL•mg-1，与未漂浆相比，下降了15 mL•g-1。漆酶用量20 U•g-1和25 U•g-1时，特性黏度值相近，分别为949 U•g-1和947 U•g-1。

综合来看，木聚糖酶用量为850 U•mg-1时，漆酶用量为20 U•g-1时，处理效果较好。

2.3 温度对马尾松KP浆预处理后性质的影响

温度对酶的影响至关重要，温度过高易失活，过低活性小；只有在最适温度下，才能达到较高活性，起到好的漂白效果。

图9 温度对酶处理马尾松浆卡伯值的影响Fig. 9 Effects of temperature on kappa number

图10 温度对酶处理马尾松浆特性黏度的影响Fig.10 Effects of temperature on viscosity

由图9可以看出，随着温度的升高，与未漂浆相比，卡伯值逐渐降低。对木聚糖酶而言，卡伯值从20℃到60℃时，下降幅度大，而且在60℃时，卡伯值最低为18.62，比未漂浆降低了4.0。漆酶系统在20℃～30℃时，卡伯值下降幅度较大，在30℃时，卡伯值最低为18.49，比未漂浆降低了4.14，而从30℃到70℃时，卡伯值都比30℃高。

由图10可以看出，经酶处理后，特性黏度都有一定程度的下降。在70℃时，经木聚糖酶处理后，特性黏度最小，为948 mL•g-1。在50℃时，漆酶介体处理后，马尾松浆特性黏度最小，为949 mL•g-1。

综合来看，在60℃时，木聚糖酶处理后，卡伯值低，特性黏度降低了13 mL•g-1，效果好；在30℃时，漆酶介体漂白效果最好，卡伯值最低，特性黏度下降了7 mL•g-1。

反应时间对马尾松KP浆预处理后性质变化影响合适的时间有助于提高酶预处理浆料的效率，时间过长、过短对生产都有影响，特别是在工业化生产阶段，时间与产品效益息息相关。

图11 时间对酶处理马尾松KP浆卡伯值的影响Fig.11 Effects of time on viscosity

图12 时间对酶处理马尾松KP浆特性黏度的影响Fig. 12 Effects of time on viscosity

由图11可以看出，随着时间的延长，与未漂浆相比，卡伯值降低。经木聚糖酶处理150 min后，卡伯值最小，为19.88，比未漂浆降低了2.75。经漆酶介体处理90 min后，卡伯值最小，为19.69，比未漂浆降低了2.94。

由图12可以看出，木聚糖酶处理180 min时，特性黏度最低，为945 mL•g-1；处理时间150 min时，特性黏度为952 ml•g-1，比未漂浆下降了13 mL•g-1。漆酶介体处理180 min时，特性黏度最低，为943 mL•g-1；处理时间为90 min时，特性黏度为954 mL•g-1，比未漂浆下降了 11 mL•g-1。

综合来看，就处理时间而言，木聚糖酶处理150 min适宜，漆酶介体处理90 min为宜。

2.5 pH值对马尾松KP浆预处理后性质变化的影响

由图13可知，pH值不同，卡伯值变化大。酶蛋白只有在合适的pH值条件下，才能展现最佳的构象和电荷性质，体现出较高的活性，才能与底物能充分结合，达到有效降解木质素的目的。木聚糖酶处理pH值为6.0和7.0时，卡伯值分别为19.87和19.94，比未漂浆下降了2.76和2.69。漆酶介体处理pH值5.0和6.0时，卡伯值分别为19.23和19.36，比未漂浆下降了3.40和3.27。

图13 pH值对酶处理马尾松KP浆卡伯值的影响Fig. 13 Effects of pH value on kappa number

图14 pH值对酶处理马尾松KP浆特性黏度的影响Fig. 14 Effects of temperature on viscosity

由图14可知，pH值为7.0时，经木聚糖酶处理后，特性黏度最低为944 mL•g-1。这与木质素的脱除也造成部分纤维的损伤有关。pH为9.0时，经两种酶处理后，特性黏度都在较低，分别为946 mL•g-1和 943 mL•g-1，比未漂浆下降了 19 mL•g-1和23 mL•g-1。这与此时碱性较强，对纤维素的部分降解与损伤有关。

综合来看，木聚糖酶和漆酶介体处理pH值6.0和5.0为宜。

2.6 纸浆质量分数对马尾松KP浆预处理后性质变化的影响

纸浆质量分数也就是工业上所指的浆料浓度，浆料浓度过大，酶不容易与其接触，漂白效果差；如果浓度过低，对于同样质量的浆料，就需要更多的漂白循环，无形中浪费了成本。相对于前述几个因子，浆浓对纸浆的性质影响较小。

图15 纸浆质量分数对马尾松KP浆卡伯值的影响Fig. 15 Effects of the pulp consistency on kappa number

图16 纸浆质量分数对马尾松KP浆特性黏度的影响Fig. 16 Effects of the pulp consistency on viscosity

由图15可以看出，马尾松浆质量分数对木聚糖酶和漆酶处理的影响趋势一致。在纸浆质量分数为10%时，经木聚糖酶和漆酶处理后，卡伯值均较低，分别为20.53和20.66，与未漂浆相比，分别降低了2.10和1.97。

由图16可以看出，质量分数为10%时，经木聚糖酶和漆酶处理后，浆料特性黏度分别为960 mL•g-1和 958 mL•g-1，与未漂浆相比，下降了 5 mL•g-1和 7 mL•g-1。

3 结论与讨论

综合来看，马尾松KP浆木聚糖酶处理最佳条件：酶用量为80 U•mg-1，时间为150 min，温度为60℃，pH值为6.0，纸浆质量分数为10%。

马尾松KP浆漆酶处理最佳条件：酶用量为20 U•g-1，吐温用量为1%，时间为90 min，温度为30℃，pH值为5.0，纸浆质量分数为10%。

木聚糖酶的价格远低于漆酶，而且对介体的依赖程度较高。因此，在工业漂白上，考虑成本、效益等因素，木聚糖酶的适用性较漆酶广泛。但是，酶的使用受到温度、pH值、处理时间等因素的限制，如何筛选出适应性强、活性高、稳定性好的木聚糖酶是亟待研究的课题。

[1] 高 慧，牛 敏， 张利萍，等.马尾松应压区与对应区制浆性能的比较[J]．东北林业大学学报，2010，38(2)：42-44.

[2] 谢维斌，赵 杨，王 琼，等.贵州省马尾松纸浆材的优树选择研究.中南林业科技大学学报，2012，32( 5) ：30-34．

[3] 张爱萍，秦梦华，徐清华，等.漆酶/介体体系对未漂马尾松磨石磨木浆改性的研究[J].中华纸业，2007,28(8):40-42.

[4] Fillat A, Roncero MB, Vidal T. Assessing the use of xylanase and laccases in biobleaching stages of a TCF sequence for flax pulp[J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology,2011, 86(12):1501-1507.

[5] 胡可信，黄 俊，刘艳新，等.马尾松化学预热机械浆镁碱过氧化氢漂白[J].长沙理工大学学报（自然科学版），2009,6(2): 83-87.

[6] Bourbonnais R. Paice M G．Oxidative of non-phenolic substances-An expanded role for laccase in lignin biodegradation[J]．FEBS Letters,1990，267 (1)：99-102．

[7] 詹怀宇，苏乾深.马尾松KP浆木聚糖酶辅助漂白生产试验[J].中国造纸，2001，20（4）：37-40.

[8] 吴淑芳，尤纪雪，叶汉玲，等.漆酶/木聚糖酶体系预处理促进马尾松硫酸盐浆漂白的研究[J].中国造纸，2010,29(16):10-13．

[9] 关 莹，张利萍，高 慧.杨木硫酸盐浆木聚糖酶漂白性质的研究[J].安徽农业大学学报，2010，37（3）：547-551.

[10] 张利萍，高 慧，关 莹，等.杨木KP浆漆酶介体的辅助漂白性质[J].东北林业大学，2010，38（10）：72-74．

[11] 詹怀宇，苏乾深.马尾松KP浆木聚糖酶辅助漂白生产试验[J].中国造纸，2001，20（4）：37-40．

[12] 林俊芳，刘志明，陈晓阳，等.真菌漆酶的酶活测定方法评价[J].生物加工过程，2009，7（4）：1-8．

[13] 董旭杰，曹福祥，陈 静， 等.3种白腐菌木质素降解酶的比较[J].中南林业科技大学学报，2007，27( 3) ：131- 135．

[14] 石淑兰，何福望.制浆造纸检测与分析[M].北京：中国轻工业出版社, 2010：22-60.

[15] 王玉峰，胡惠仁，石淑兰.漆酶介体系统对高木素含量的KP浆的生物漂白化学[J].天津造纸，2006，28（4）：41-46．

[16] 金永灿，夏海霞，陆晓坤，等.吐温80对麦草浆过氧化氢漂白的促进作用[J].纤维素科学与技术，2007，15(4)：23-27.

Effects of two biological enzymes on assisted bleaching properties of Pinus massoniana kraft pulp

ZHANG Li-ping1, GAO Hui1, GUAN Ying2, HUANG Bo1
(1.School of Forestry and Landscape Architecture, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, Anhui, China; 2.School of Materials Science and Technology, Beijing Forestry University, Beijing 100083)

Pinus massoniana kraft pulp was selected as the tested material. Effects of several important factors in xylanase and laccase assisted bleaching system on Pinus massoniana kraft pulp were tested respectively. The results show as the follows. For laccase, when the dosage of ABTS was from 0 mg·g-1to 10 mg·g-1, the kappa number reduced as the dosage of ABTS increased. When the amount of tween 80 was 1%, the kappa number was the lowest. When the amount of xylanase and laccase were 80 U•mg-1and 25 U·g-1respectively,the treatment effects were better. When the xylanase and the laccase system of temperatures were at 60℃ and 30℃ , time was 150 and 60 minutes, the kappa numbers were the lowest. The pH values of the xylanase and laccase system were 6.0 and 5.0, the kappa number accordingly reduced by 2.76 and 3.40. For the two enzymes assisted bleaching system, when the pulp consistency was 10%, the effects were better.

Pinus massoniana kraft pulp; xylanase; laccase mediator; kappa number; viscosity

S784

A

1673-923X(2012)11-0171-06

2012-08-29

安徽省自然科学基金（1208085MC37）；安徽农业大学校长青年基金

张利萍（1980-），女，实验师，读博士研究生，主要从事木材性质研究与应用；E-mail:zhangliping@ahau.edu.cn

黄 勃，教授，博士生导师，主要从事虫生真菌分类和分子生物学研究

[本文编校：欧阳钦]