GPC-HPLC-RP法检测熏烧烤肉制品中的苯并（a）芘

施煜,杨建英,朱虹,郑晓冰,赵质创,韩飞

（汕头市质量计量监督检验所，广东省质量监督食品检验站（汕头）， 广东汕头 515041）

GPC-HPLC-RP法检测熏烧烤肉制品中的苯并（a）芘

施煜,杨建英,朱虹,郑晓冰,赵质创,韩飞

（汕头市质量计量监督检验所，广东省质量监督食品检验站（汕头）， 广东汕头 515041）

采用MPS全自动样品净化系统中的GPC凝胶渗透色谱净化熏烧烤肉制品中的苯并（a）芘 （BaP），并用高效液相色谱荧光法（HPLC-RP）测定BaP的含量。GPC条件：GPC凝胶渗透色谱柱，以环己烷-乙酸乙酯（体积比50︰50）为流动相，流速 4.7 mL/min，收集时间为 15～21 min。HPLC 条件：Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（体积比88︰12），流速为1.0 mL/min；柱温：30℃；进样量：10 μL；激发波长：384 nm；发射波长：406 nm。该方法线性关系良好，加标回收率为 82.4%～91.3%，相对标准偏差小于5%，检出限为0.15 μg/kg。方法简化了手工操作，有效地去除了熏烧烤肉制品中的色素及脂肪干扰，可应用于熏烧烤肉制品中BaP的测定。

苯并（a）芘；GPC；高效液相色谱；熏烧烤肉制品

熏烧烤肉是深受消费者喜爱的传统肉制品，在我国肉制品体系中占有重要地位，而熏烧烤肉制品中的苯并（a）芘（BaP）污染，是造成人体中BaP危害的主要来源。BaP是由5个苯环构成的多环芳烃，是一种公认的强致癌物，已成为环境污染中的重要监测物质[1,2]。BaP能够引起皮肤、肺、食道等部位的肿瘤和癌变，广泛存在于水、大气、土壤、动物和植物中，尤其是当熏、烧、烤畜肉、禽肉和水产品类等食物时，肉制品中BaP的含量会急剧升高，其原因是在加工过程中肉类本身会生成BaP，加工过程中也易受到烟灰等污染[3,4]。目前，BaP对食品的污染已受到世界各国的重视，许多国家都制定了食品中的BaP限量。我国GB 2726-2005 《熟肉制品卫生标准》规定了BaP在肉制品中的残留应在5 μg/kg 以下。

但由于肉制品中BaP 含量低、样品基体复杂、干扰成分多，因此分析测定难度较大。目前我国主要依据GB/T 5009.27-2003 《食品中苯并（a）芘的测定》，采用荧光分光光度法和目测比色法进行分析，但这两种方法分析时间长，操作过程复杂，费时、费溶剂、溶剂毒性大、准确度较低，尤其是在滤纸上点样和展开时，存在样品斑点扩散大、滤纸背景干扰等问题，导致难以观测到所要取用的荧光斑点。我国农业行业标准NY/T 1666-2008 《肉制品中苯并(а)芘的测定 高效液相色谱法》，采用高效液相色谱法进行分析，该法分离效果好、检出限低，但是存在样品回收率低等问题。国外主要应用高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法等先进的检测技术，这些方法灵敏度高、回收率好[5]。

目前，由于检测技术差异造成的技术壁垒严重影响了我国熏烧烤肉制品的出口，因此对熏烧烤肉制品中残留及检测技术的研究不仅是食品安全性研究的一个重要方面，更是提高国产肉制品质量，扩大出口所面临的技术难题。笔者采用AccuPrep MPS全自动样品净化系统中的GPC凝胶渗透色谱净化熏烧烤肉制品中的 BaP，利用高效液相色谱荧光法（HPLC-RP）检测 BaP含量，取得了较满意的效果。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Agilent 1200型，配荧光检测器，美国安捷伦公司；

凝胶渗透色谱及在线浓缩仪： AccuPrep MPS GPC型，美国J2 Scientific公司；

环己烷、正己烷、石油醚、二氯甲烷、苯、二甲基亚砜、乙酸乙酯、甲醇、乙腈：色谱纯，美国Tedia公司；

苯并（a）芘标准品：国家标准物质中心；

滤膜：0.22 μm，有机相；

实验用水为去离子水。

1.2 GPC 条件

GPC凝胶渗透色谱柱（P/N: C0785）；流动相：环己烷-乙酸乙酯（体积比50∶50），流速：4.7 mL/min。

1.3 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18（ 250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（体积比88∶12），流速为1.0 mL/min ；柱温：30℃；进样量：10 μL ；激发波长：384 nm；发射波长：406 nm。

1.4 样品前处理

称取均匀粉碎试样约5 g，置于50 mL离心管中，加入15 mL环己烷，涡旋处理1 min，超声提取15 min，以4 200 r/min离心5 min，收集上清液。残渣分别用10 mL环己烷重复提取2次，合并环己烷提取液，经旋转蒸发浓缩，定容至5 mL后，与5 mL乙酸乙酯混匀。取5 mL混合液，过AccuPrep MPS GPC净化系统，定时收集的净化液经在线浓缩系统浓缩至2 mL，氮吹干燥，用1 mL甲醇溶解，过0.22 μm有机相滤膜，供HPLC-RP检测分析。

1.5 加标回收率及检出限的测定

称取均匀粉碎试样约2 g，添加适量的BaP标准品，混匀，按1.2～1.4进行操作。对添加低浓度水平的BaP标准品的熏肉进行测定，得到方法的检出限。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

实验选用正己烷、环己烷、石油醚、二氯甲烷、苯、二甲基亚砜6种溶剂作提取剂，比较了6种溶剂的提取效率，结果表明环己烷的提取效率最高，经过3次超声提取，样品中的BaP提取率可达90%以上。

2.2 流动相的选择

流动相是HPLC检测样品中操作条件的关键因素。通过比较乙腈-水和甲醇-水的不同配比分别作为流动相，结果显示，当使用乙腈-水体积比为88∶12时，不仅BaP的保留时间适宜,峰形良好，而且基线稳定、灵敏度高，与样品中干扰物能达到较好的基线分离。

2.3 检测器的选择

BaP在紫外和荧光下都有吸收峰，但荧光检测器只对带荧光基团的物质有响应，因此可有效去除那些不带有荧光基团的杂质对样品测定的干扰，大大提高BaP的检测灵敏度，故实验采用荧光检测器进行检测。

由于大多数有荧光的化合物在230 nm波长下都能被激发，因此在230 nm 激发波长下选择多波长发射，发现406 nm为最佳发射波长。在固定406 nm发射波长后选择多波长激发，最终选择激发波长384 nm，发射波长为406 nm。在此条件下，BaP标准样品的色谱图见图1。

图1 BaP标准样品的色谱图

2.4 GPC条件的选择

将BaP标准溶液经GPC过柱，进样量为5 mL，流动相为环己烷-乙酸乙酯（体积比1∶1），观察BaP的紫外扫描图，发现BaP的流出时间主要集中在16～20 min，故选择收集时间为15～21 min。通过高效液相色谱检测烤肉样品，研究发现，GPC可将BaP从复杂基质中净化出来，能有效去除烤肉制品中大量的脂肪及其它脂溶类物质。

2.5 线性关系与检测限

对BaP标准溶液逐级稀释后，配制浓度为2.5，5.0，10.0，25.0，50.0，100.0 μg/L 的系列标准工作溶液，并进样测定，以峰面积A对BaP浓度c（μg/L）进行线性回归，得线性方程为A=1.131 3c+2.213 8，线性相关系数r=0.999 85。根据对添加低浓度水平的BaP样品的测定，以10倍信噪比计算检出限，方法的检出限为0.15 μg/kg。

2.6 加标回收率和精密度

为了计算检测方法的回收率和考察方法的精密度，向烤肉和熏肉样品中分别加入两种不同浓度BaP标样（见表1），利用GPC净化处理样品，并采用HPLC-RP法进行检测。

表1 精密度及回收试验结果（n=5）

结果显示，选定的样品预处理方法，使样品得到了很好地净化，且样品中BaP的加标回收率均在80%以上，相对标准偏差不大于5%，符合食品检验分析的要求。

3 结语

通过AccuPrep MPS全自动样品净化系统中的GPC凝胶渗透色谱有效地去除了熏烧烤肉制品中的色素及脂肪干扰，简化了手工操作过程，有效地去除了熏烧烤肉制品中的各种干扰物，简便、准确地测定了熏烧烤肉制品中苯并（a）芘的含量。

[1]李伟红，戴廷灿，周瑶敏，等. 高效液相色谱法测定熟肉制品中的苯并（a）芘[J]. 江西农业学报, 2008, 20(1): 86-88.

[2]吴海智, 周丛, 袁列江，等. 高效液相色谱法快速测定植物油中苯并（a）芘的研究[J]. 安徽农业科学, 2011, 39(1): 6 075-6 076.

[3]刘福岭, 戴行均. 食品物理与化学分析方法[M]. 北京: 轻工业出版社, 1987: 41l-425.

[4]田晓玲, 柏云江. 高效液相色谱法测定饲料中的苯并（a）芘[J].饲料工业, 2005, 26(1): 53-54.

[5]Meudec A, Dussauze J, Jourdin M, et al. Gas chromatographic-mass spectrometric method for polycyclic aromatic hydrocarbon analysis in plant biota[J]. Journal of Chromatography, 2006, 1 108(2):240-247.

Determination of Benzo (a) Pyrene in Smoked Barbecue Meat Products by GPC-HPLC-RP

Shi Yu, Yang Jianying, Zhu Hong, Zhen Xiaobing, Zhao Zhichuang, Han Fei
[Shantou Institute of Quality and Metrology Supervision Testing, Guangdong Food Supervision Inspection Station (Shantou),Shantou 515041, China]

A method for quantitative detection of benzo (α) pyrene in smoked barbecue meat products by GPC of Accu Prep MPS and HPLC-RP was established. GPC conditions: gel permeation chromatography (GPC) was selected;mobile phase was cyclohexane-ethyl acetate (50∶50), flow rate was 4.7 mL/min, and collection for 15-21 min. HPLC conditions:Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm), flow rate was 1.0 mL/min, mobile phase was acetonitrile-water(88∶12), column temperature was 30℃ , sampling volume was 10 μL, excitation wavelength was 386 nm and emission wavelength was 406 nm. The results showed that the standard curve of BaP had good linearity, the recovery rate was 82.4%－91.3%, the relative standard deviation was less than 5%, and the detection limit was 0.15 μg/kg. In this method,the manual operation was simplified, and the interference of pigment and fat were apart from smoked barbecue meat products. The method may be applied to determine the BaP in smoked barbecue meat products.

benzo (a) pyrene; GPC; high performance liquid chromatography; smoked barbecue meat products

O656.31

A

1008-6145(2012)01-0052-03

10.3969/j.issn.1008-6145.2012.01.016

联系人：韩飞；E-mail:fei.han@163.com

2011-10-18