高效液相色谱法测定肉制品中甘草抗氧化物的含量*

谭波涛，郝媛媛，丁轶聪

（阜阳市产品质量监督检验所，安徽阜阳 236112）

高效液相色谱法测定肉制品中甘草抗氧化物的含量*

谭波涛，郝媛媛，丁轶聪

（阜阳市产品质量监督检验所，安徽阜阳 236112）

建立了测定肉制品中甘草抗氧化物含量的方法。样品经流动相提取，采用C18色谱柱分离，以甲醇-0.2 mol/L乙酸铵-冰乙酸（体积比70∶29∶1）为流动相，流速为1.0m L/m in，波长为250nm，以保留时间进行定性，峰面积进行定量。甘草酸在 1.0～80.0μg/m L 范围内线性关系良好，回归方程为 y=8.55×10－5x-0.599（r=0.999 7），检出限为 1.0mg/kg，定量限为 3.0mg/kg，加标回收率为 95.7%～103.4%，测定结果的相对标准偏差为 1.57%～3.53%（n=6）。该方法适用于检验机构日常检验中大批量肉制品中甘草抗氧化物含量的测定。

高效液相色谱；肉制品；甘草抗氧化物

甘草抗氧化物（Antioxidant of glycyrrhiza,CNS号 04.008）是一种抗氧化剂，以甘草中提取出的甘草浸膏或甘草酸后的残渣为原料，用乙醇或其它有机溶剂提取后经脱溶浓缩、干燥而得的产品[1,2]，其含量通常以甘草酸计。甘草酸分子式为C42H62O16,摩尔质量为822.93 g/mol。《食品添加剂使用卫生标准》[3]中规定，在基本不含水的脂肪和油、方便米面制品、饼干、腌腊肉制品、酱卤肉制品、熏烧烤肉类、油炸肉类、西式火腿、肉灌肠类、发酵肉制品、腌制水产品、油炸食品等中允许限量使用，最大使用量均为0.2 g/kg，在其它食品中不允许使用。临床医学研究证明，长期滥用甘草酸会产生全身浮肿、血钠浓度增高等现象，最终导致高血压等疾病。

肉制品中甘草抗氧化物的测定，目前国内缺少相应的标准方法，文献报道的多为高效液相色谱法、薄层扫描法等测定中药材中的甘草酸含量[4-8]。笔者建立一种高效液相色谱法测定肉制品中甘草抗氧化物的方法，该方法精密度、准确度高，检出限低，实用性强，适用于检验机构日常检验需求。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Aglient 1260型，配二级管阵列检测器、多功能自动进样器，美国Aglient公司；

去离子水发生器：AXLB 1020-1型，美国阿修罗科技发展有限公司；

高速旋转离心机：TDZ 4-WS型，西安东瑞科教实验仪器有限公司；

电子天平：BSA 224S型，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；

超声波仪：SK 1200H型，上海科导超声仪器有限公司；

甲醇：色谱纯；

甘草酸标准品：纯度不低于99%，上海安谱科技有限公司；

亚铁氰化钾、乙酸锌、乙酸铵、冰乙酸：分析纯；实验室用水为超纯水。

1.2 色谱条件

色谱柱：Aglient C18柱（250mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：甲醇 -0.2 mol/L 乙酸铵 -冰乙酸(体积比 70∶29∶1)；流速：1.0m L/m in；进样量：10µL ；柱温：30℃。

碳交易促进企业改善技术水平，提高长期经济效益。碳交易市场是政府根据外部性原理强行创造出来的一个新市场，所以碳交易市场在诞生和成长过程中，影响最大的都是政策性因素；当地区生产总值较高时，碳排放数量也较高，但是碳排放数量高不一定导致碳交易金额高，一般来说，碳配额不足的企业会购买配额，碳配额多余的企业会出售配额，但是企业的碳配额充足与否与企业的碳排放数量无关，主要与企业自身的技术水平和碳交易政策等因素相关；企业无法改变国家的碳交易政策，所以企业会不断改善技术水平，以降低碳排放成本，同时提高企业的长期经济效益。

1.3 样品前处理

称取样品 2.0～3.0g（精确至 0.1 mg）于 25 m L比色管中，用流动相适当溶解并稀释样品，然后加入乙酸锌溶液（220g/L）和亚铁氰化钾溶液（106 g/L）各2 m L，稍震荡后用流动相定容至25 m L,超声30min，以3 000r/m in高速离心10m in，取上清液待测。

1.4 甘草酸标准溶液的制备

准确称取甘草酸标准品适量，以流动相溶解定容，配制成1.0mg/m L标准储备液。

1.5 测定方法

取10μL样品溶液和甘草酸标准使用溶液,分别注入高效液相色谱仪中,按1.2色谱条件,以色谱峰的保留时间定性,外标峰面积法定量测定。

2 结果与讨论

2.1 提取方法的考察

甘草酸易溶于热水、醇等极性溶液，几乎不溶于乙醚。在方法研究时，对肉制品中甘草酸的提取用10%甲醇水溶液、20%甲醇水溶液、50%甲醇水溶液、流动相等作为溶剂进行提取比较，提取结果见表1。

表1 不同溶剂的提取结果

由表1数据可知，当使用流动相作为提取液进行提取时，提取率最高，因此采用流动相作为提取液。

2.2 样品前处理方法的考察

针对含油脂及蛋白质量较多的肉制品，采用加沉淀剂法去除干扰，试验中分别加沉淀剂乙酸锌－亚铁氰化钾溶液 0.0，2.0，5.0m L 进行比较分析实验。结果显示，当沉淀剂添加量为0.0m L时，干扰峰较多；当添加量为2.0m L和5.0m L时，干扰峰较少，而甘草酸的回收率在可接受范围内，选择沉淀剂添加量为 2.0m L。

2.3 检测波长的选择

利用二极管阵列检测器对甘草酸标准溶液进行紫外光谱检测。从甘草酸标准品色谱峰最高点提取的三维光谱图发现，标准品在250nm附近有最大特征吸收。因此实验选择250nm作为甘草酸的检测波长。

2.4 流动相的选择

甘草酸因含有羧基而显酸性，因此在流动相中加入少量酸性改性剂可以增加流动相的极性，降低待测物在色谱柱上的保留时间，以改善峰形；同时，在流动相中添加适量乙酸铵缓冲盐能抑制样品的电离，稳定样品和pH值，优化色谱系统，为样品的键合提供良好的环境，使峰型更好。实验比较了乙腈-水-磷酸、甲醇-水-甲酸、甲醇-0.2 mol/L乙酸铵-冰乙酸等不同体系和比例流动相下样品的分离情况，发现当流动相为甲醇-0.2 mol/L乙酸铵-冰乙酸（70∶29∶1）时，样品分离较好，响应值较高，且此时流动相的pH值亦在色谱柱的耐酸范围内。

图1 肉类样品中甘草酸的色谱图

2.5 色谱柱的选择

根据甘草酸的性质及色谱柱的类别，对C8、C18等色谱柱进行分析比较试验，发现C18色谱柱的分离效果最好。

2.6 线性方程及检出限

吸取标准储备液适量配制 1.0，10.0，20.0，40,0，80.0μg/m L系列浓度，绘制标准曲线，结果显示，甘草酸浓度在1.0～80.0μg/m L范围内线性关系良好，回归方程为 y=8.55×10-5x–0.599（r=0.999 7）。

同时选定 3 个低浓度 2.0，4.0，10.0µg/m L 的标准溶液，对每一浓度水平分别重复测定6次，求出每个浓度测定结果的标准偏差s1，s2，s3，用线性回归法作回归曲线，求出浓度为零时空白样品的标准偏差s0。定义3s0所对应的浓度为方法的检出限，10s0所对应的浓度为方法的定量限，得出本方法的检出限为 1.0mg/kg，定量限为 3.0mg/kg。

2.7 回收试验

随机抽取本底值为零的市售酱牛肉样品进行加标回收试验，每一样品平行测定6次，结果见表2。

表2 回收试验结果

由表2可见，该方法测定的加标回收率为95.7%～103.4%，测定结果的相对标准偏差为1.57%～3.53%（n=6）。回收率的测定结果符合《实验室质量控制规范 食品理化检测》[9]中表F.1中要求。

2.8 精密度试验

随机抽取一市售酱牛肉按1.3法进行处理，重复测定6次，测定结果为30.869 2，29.562 5，29.954 6,30.258 9，30.104 6，28.996 8 µg/m L，相对标准偏差为2.1%，符合《实验室质量控制规范 食品理化检测》[9]中表F.3中要求。

2.9 准确度试验

对含甘草酸浓度为 10.0，40.0，80，200.0µg/m L的溶液分别进行4次重复分析,结果见表3。结果显示，测定含量（经回收率校正）平均值与真值的偏差为-4.7%～3.20%，符合《实验室质量控制规范食品理化检测》[9]中表F.5中要求。

表3 准确度试验结果

3 结语

建立了用高效液相色谱仪测定肉制品中甘草抗氧化物含量方法，该方法准确度高、灵敏度好、检出限低、实用性强，适合于检验机构日常检验工作中大批量肉制品中甘草抗氧化物含量的测定。

[1] 徐树芸，王海宁.HPLC测定甘草提取物中甘草酸的含量[J].安徽农业科学，2008,36(24):10297-10300.

[2] 赵祎镭,师清芝,唐星.甘草中甘草酸和甘草苷的提取纯化工艺研究[J].中国药房,2009,20(6):426-429.

[3] GB 2760-2010食品添加剂使用卫生标准[S].

[4] ISO 11023-1999 Liquorice extracts (Glycyrrhiza glabra L.)-Determ ination of glycyrrhizic acid content - Method using highperformance liquid chromatography [S].

[5] 方从容，杨大进.保健食品中甘草酸测定方法的研究[J].中国卫生检验杂志,2007,17(6):986-987.

[6] 张萍，马银海，郭亚东等.RP-HPLP法测定果脯中甘草苷和甘草酸的含量[J].食品科学,2007,28(5):284-286.

[7] 李萍，何筱毅，周佳.炙甘草合剂中甘草酸含量测定[J].现代医药卫生，2009,25（10）:1 451-1 453.

[8] 胡昌江，李兴华，杨婷，等.高效液相色谱法测定理中汤配方颗粒中甘草酸含量[J].中国药业，2006,15(4):10-11.

[9] GB/T 27404-2008 实验室质量控制规范 食品理化检测[S].

Determ ination of Antioxidants Licorice in M eat by High-Performance Liquid Chromatography

Tan Botao, Hao Yuanyuan, Ding Yicong
( Fuyang Institute of Product Quality Supervision and Inspection, Fuyang 236112，China )

A method for determ ination of the antioxidants licorice in meat was established. The samples were extracted by the mobile phase, separated by C18column. Methanol-0.2 mol/L ammonium acetate-acetic acid (volume ratio was 70∶29∶1) was as mobile phase w ith the fl ow rate of 1.0m L/m in. The sample was qualitatived by the retention time and quantitatived by the peak area, the detection wavelenth was 250nm. The calibration curve was linear in the range of 1.0-80μg/m L, r=0.999 7. The limit of the detection was 1.0mg/kg, the limit of quantifi cation was 3.0mg/kg, the recovery ranged from 95.7% to 103.4%and the RSD was 1.57%-3.53%（n=6）. This method is suitable for the determ ination of antioxidants licorice in meat for routine inspection work.

high performance liquid chromatography; meat; antioxidants licorice

O657.7+2；TS207.3

A

1008-6145(2012)01-0040-03

10.3969/j.issn.1008-6145.2012.01.012

* 2010年安徽省质量技术监督局科技计划项目(ZJY-018)

联系人：郝媛媛；E-mail:446903913@qq.com

2011-10-25