南蛇藤中扁塑藤素对照品的制备及鉴定

张立 王定勇

南蛇藤中扁塑藤素对照品的制备及鉴定

张立 王定勇

目的建立从南蛇藤(Celastrus orbiculatus Thunb.)根皮中制备扁塑藤素(pristimerin)对照品的方法。方法采用溶剂提取、硅胶柱层析和重结晶等方法对南蛇藤根皮丙酮提取物进行分离纯化，通过MS、IR、1H-NMR和13C-NMR进行结构鉴定，通过薄层色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)对对照品进行纯度检测。结果从南蛇藤根皮中分离纯化出扁塑藤素对照品，质量分数＞99.0%。结论该方法制备的扁塑藤素对照品符合中药化学对照品的相关要求，可作为南蛇藤及其制剂质量控制用的化学对照品。

南蛇藤根皮;南蛇藤;对照品制备

南蛇藤(Celastrus orbiculatus Thunb.)系卫矛科南蛇藤属植物，又名过山风、降龙草等。该植物生于山谷溪边灌丛或林边，在我国分布广泛，除青海和新疆未见记载外，其他地区均有分布。南蛇藤全草均可入药，有袪风湿，活血脉，消肿解毒等功效，常用于治疗筋骨疼痛，四肢麻木，痈疽肿毒，小儿惊风，痧症，痢疾等症［1］。目前已从南蛇藤植物中分离得到60余个化合物，主要为β-二氢沉香呋喃倍半萜、生物碱、三萜类，此外还含有黄酮类、有机酸类、甾体及鞣质［2］。笔者在南蛇藤药材的质量控制研究过程当中，由于缺少化学对照品，因而无法准确控制南蛇藤药材及其相关制剂的质量，因此，迫切需要研制一种或多种对照品。扁塑藤素(pristimerin)是南蛇藤中的一种重要化学物质，具有广谱抗肿瘤［3，4］、抗炎［5］、抗氧化［6］等多种药理活性，且在南蛇藤中含量较高。本文从南蛇藤中提取、分离和纯化扁塑藤素，制备扁塑藤素对照品，为制定和完善南蛇藤及其制剂的质量标准提供扁塑藤素对照品。

1 仪器及材料

X-6显微熔点测定仪(北京泰克仪器有限公司，未校正);Nicolet PROT-G-460红外光谱仪(KBr压片，美国Nicolet公司);Agilent6120型质谱仪(美国Agilent公司);Bruker AM-500型核磁共振仪(TMS为内标，瑞士Bruker公司);LC-10ATvp型高效液相色谱仪(SHIMADZU公司);SPD-M10Avp紫外检测器(SHIMADZU公司)。摇摆式高速中药粉碎机(大德中药机械有限公司)，RE-52CS旋转蒸发器(河南省巩义市英峪予华仪器厂)。

南蛇藤于2008年10月采自广东阳春市，由广东药学院中药学院李树渊教授鉴定为南蛇藤(Celastrus orbiculatus Thunb.)，标本存放于广东药学院天然药物化学实验室。硅胶(200～300目，青岛海洋化工厂)，聚酰胶(60～100目，浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂)，水为蒸馏水，色谱用甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 扁塑藤素的制备 取南蛇藤根皮1 kg粉碎至60目左右，置于一5L规格圆底烧瓶中，用丙酮3500 ml为提取溶剂，回流提取2次，每次提取1.5 h，抽滤，滤液合并后减压浓缩得浸膏150 g;上述浸膏(150 g)先进行聚酰胶(60-100目，2 kg)柱(Ф150 mm ×L1500 mm)层析，以甲醇-水 =4:1(V/V)为洗脱剂，流速≤6 ml/min，收集红色洗脱液，减压浓缩该洗脱液得红色粉末状固定(45 g);该红色粉末状固定(45.0 g)再进行硅胶(200～300目，1 kg)柱(Ф100 mm×L1000 mm)色谱，流速≤6 ml/min，依次用洗脱剂 φ110000 ml、洗脱剂φ2 50000 ml洗脱色谱柱，收集φ2洗脱液部分收集(其中洗脱剂φ1由石油醚和乙酸乙酯按体积比20:1组成;洗脱剂φ2由石油醚和乙酸乙酯按体积比10∶1组成);将上述φ2洗脱液置于旋转蒸发仪上减压蒸发去除溶剂后得到扁塑藤素粗品(25.0 g);将扁塑藤素粗品用石油醚-乙酸乙酯(10:1，V/V)150 ml回流溶解，趁热抽滤去除不溶性杂质，滤液重新回流至澄清后先置于室温2 h，然后放置0℃冰箱中析晶，24 h后有大量橙红色针状晶体析出，抽滤，收集红色针状晶体，即得扁塑藤素纯品(8.5 g)。

图1 扁塑藤素对照品的核磁共振氢谱

图2 扁塑藤素对照品的核磁共振碳谱

2.2 对照品的理化性质及结构鉴定橙红色针状晶体(石油醚-乙酸乙酯)，mp.219.0 ～220.0℃。ESI-MS(positive mode)m/z:487 ［M+Na］+，465 ［M+H］+，263，202，201;IR νmax(KBr)cm-1:3350，2940，1725，1650，1590，1520，1435，1375，1300，1245，1220，1205，1185，1155，l145，1095，1085，990，870，860，850;1H-NMR(500 MHz，CDCl3):δ 7.02(1H，d，J=7.1Hz，H-6)，6.52(1H，s，H-1)，6.34(1H，d，J=7.1Hz，H-7)，6.96(1H，brs，-OH)，3.52(3H，s，H-31)，2.23(3H，s，H-23)，1.45(3H，s，H-25)，1.25(3H，s，H-26)，1.17(3H，s，H-30)，1.08(3H，s，H-28)，0.52(3H，s，H-27);13C-NMR(125 MHz，CDCl3):δ 119.5(C-1)，178.2(C-2)，146.0(C-3)，117.2(C-4)，127.4(C-5)，134.2(C-6)，118.1(C-7)，170.3(C-8)，43.0(C-9)，164.8(C-10)，33.5(C-11)，29.6(C-12)，39.4(C-13)，45.0(C-14)，28.6(C-15)，36.4(C-16)，30.5(C-17)，44.3(C-18)，30.9(C-19)，40.4(C-20)，29.9(C-21)，34.8(C-22)，10.2(C-23)，38.2(C-25)，21.6(C-26)，18.3(C-27)，31.6(C-28)，178.7(C-29)，32.7(C-30)，51.5(C-31)。以上数据与文献［7］报道的扁塑藤素(pristimerin)相关数据一致。见图1～3。

图3 扁塑藤素对照品的质谱

2.3 对照品的纯度检测

2.3.1 对照品的薄层色谱法检查 将对照品用甲醇配制成1 mg/ml的溶液，分别点样 5、10、20 μL，分别以石油醚-乙酸乙酯(体积比2∶1)、三氯甲烷-丙酮 (体积比3∶1)和三氯甲烷-甲醇(体积比20∶1)为展开剂，在硅胶G板上展开。分别在365 nm紫外灯、日光下观察以及碘缸中显色观察。结果表明，在3种展开剂中对照品均为1个斑点，未见其他杂质斑点，Rf值分别为0.55、0.65和0.78。

图4 扁塑藤素对照品的HPLC图

2.3.2 对照品的HPLC法检查 称取扁塑藤素0.001 g，在甲醇溶液中溶解并定容到10 ml，得到质量浓度为0.1 mg/ml的样品溶液。取上述样品溶液1 ml用流动相定容到50 ml，得到质量浓度为2 μg/ml的对照品溶液。色谱柱为迪马公司 DiamonsilTM C18柱(5 μm，250 mm ×4.6 mm)，以甲醇-0.1%H3PO4(体积比88∶12)为流动相，流速为1 ml/min，柱温为35℃，检测波长为258 nm，对照品溶液质量浓度为2 μg/ml，进样量为20 μl。结果表明，在该色谱条件下所得HPLC图谱中显1个主峰，保留时间为9.82 min，质量分数以峰面积归一化法计算为99.69%。在改变流动相分析及将釆集时间延长数倍时，均未出现异常峰。RP-HPLC色谱图见图4。

［1］ 江苏新医学院，中药大辞典(下册).上海:上海科学技术出版社，2000:1563-1567.

［2］ 陈源旺，丁立平，欧阳明安.南蛇藤化学成分研究进展.亚热带植物科学，2007，36(1):79-84.

［3］ WU C C，CHAN M L，CHEN W Y，et al.Pristimerin induces caspase-dependent apoptosis in MDA-MB-231 cells via direct effects on mitochondria.Mol.Cancer Ther， 2005， 4(8):1277-1285.

［4］ YANG H J，LANDIS-PIWOWAR K R，LIU D，et al.Pristimerin induces apoptosis by targeting the proteasome in prostate cancer cells.J Cell Biochem，2008，103:234-244.

［5］ 惠斌，吴勇杰，王鸿，等.扁蒴藤素对急性实验性炎症的作田及其机制研究.中国药理学通报，2003，19(6):656-659.

［6］ 陈长瑞，李文广，吴勇杰，等.扁蒴藤素的抗氧化与抗肿瘤作用.中药药理与临床，2002，18(5):20-21.

［7］ 蒋毅，李鹤，罗思奇，等.南蛇藤活性成分的研究.中草药，1996，27(2):73-74.

Preparation and identification of pristimerin reference substance from Celastrus orbiculatus

ZHANG Li，WANG Ding-yong.Department of Pharmacy， Guangdong Provincial Hospital of TCM， Guangzhou 510120，China

Objective To establish a method for preparation of pristimerin reference substance from the root bark of Celastrus orbiculatus Thunb.Methods Pristimerin was isolated and purified from the acetone extract of the root bark of C.orbiculatus by solvent extraction，silica gel column chromatography and re-crystallization respectively.Its structure was identified by MS，IR，1H-NMR and13C-NMR.Its purity was detected by thin layer chromatography(TLC)and high pressure liquid chromatography(HPLC).Results Pristimerin reference substance was obtained from the stem bark of C.orbiculatus，and its purity was over 99.0%.Conclusion Pristimerin reference substance prepared by this method can meet the demands of Chinese drug chemical reference substances and be used in the quality control of the C.orbiculatus materials including its preparations.

Root bark of Celastrus orbiculatus;Pristimerin;Preparation of reference substances

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2012.11.010

510120广东省中医院药学部(张立);广东药学院药科学院(王定勇)

王定勇 E-mail:wdingyong@163.com