葛根总黄酮对刀豆蛋白A诱导的小鼠免疫性肝损伤保护作用及其机制的初步研究

方士英，徐茂红，赵克霞，张小勇，汪洋奎，顾宏霞，陈秀明，罗太敏

(皖西卫生职业学院1.药学系、2.附属医院，安徽 六安 237000)

病毒性肝炎(viral hepatitis)是常见病、多发病，通过一系列的免疫应答可引起肝细胞损伤，其中以细胞免疫为主，特别是TNF-α大量释放，可导致肝脏急性出血性坏死［1］。葛根是豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi.的干燥根，含多种黄酮类成分，具有解酒毒、降血脂等多种药理活性［2］。本研究采用刀豆蛋白A诱导小鼠免疫性肝损伤模型，探讨葛根总黄酮(TPF)的保护作用，以期为葛根总黄酮在病毒性肝炎等免疫性肝损伤中的应用提供依据。

1 实验材料与方法

1.1材料昆明种小鼠，♂，体质量20～26 g，SPF级，购自安徽省实验动物中心，合格证号为SCXK(皖)2011-001;葛根总黄酮:霍山野生葛根提取，安徽大别山葛业有限公司提供(总黄酮含量≥80%);联苯双酯(bifendate，BF):浙江医药股份有限公司新昌制药厂(批号:090801);刀豆蛋白A(美国Sigma公司);考马斯亮蓝、MDA、SOD、ALT、AST 试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，批号分别为 20110402、20110623、20110624、20110624、20110620;IFN-γ、TNF-α 试剂盒为eBioscience公司产品;UV1200紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司;酶标仪(DNA9602)，北京普朗新技术有限公司。

1.2方法

1.2.1分组60只小鼠按体重随机分为正常组、阳性药组(BF，200 mg·kg－1)、模型组、TPF 高、中、低(200、100、50 mg·kg－1)剂量组(生药量)，每组10只。

1.2.2造模按免疫性肝损伤造模方法［3］，模型组尾静脉注射Con A生理盐水液20 mg·kg－1，造成急性免疫性肝损伤模型。

1.2.3给药BF组和TPF高、中、低剂量组按0.2 ml·(10 g)－1体重每日灌胃给药1次，正常组和模型组每日灌胃等体积的生理盐水溶液1次，连续灌胃10 d。末次灌胃后，除正常组尾静脉注射生理盐水外，其余各组均尾静脉注射Con A生理盐水液20 mg·kg－1。禁食8 h后，摘眼球取血离心，留取血清待检。

1.2.4指标测定末次给药禁食8 h后摘除眼球取血，离心15 min(3 000 r·min－1)，分离血清，测定血清中 ALT、AST值。取10%肝匀浆用同样时间离心得上清液，测定上清液中 MDA、SOD、IFN-γ、TNF-α 含量，其中 IFN-γ、TNF-α 采用ELISA法测定。各项检测严格按试剂盒标示方法操作。

1.3肝脏病理学观察取相同部位肝组织，用福尔马林溶液固定，石蜡包埋，做石蜡切片，每例均进行苏木精－伊红(HE)染色，光镜下观察肝组织的病理变化。

1.4统计学处理数据应用SPSS 11.0软件包处理，实验结果均以±s表示，组间显著性用t检验及相关分析。

2 结果

2.1TPF对Con A致免疫性肝损伤小鼠血清中ALT、AST和 肝匀浆中MDA、SOD、IFN-γ、TNF-α的影响模型组小鼠与正常组比较差异有显著性(P＜0.05);TPF高、中、低剂量组与模型组比较，其小鼠血清ALT、AST、肝匀浆中MDA、IFN-γ、TNF-α含量降低，差异有显著性(P＜0.05);肝匀浆中SOD升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。见Tab 1。

Tab 1 Influence of TPF on ALT，AST in serum and MDA，SOD，IFN-γ，TNF-α in liver homogenate of mice induced by Con A(±s，n=10)

#P＜0.05 vs model;*P＜0.05 vs control

Group Dose/mg·kg－1 Pro Control - 52.4 ±9.69 72.5 ±7.62 1.78 ±0.15 98.6 ALT/IU·L－1 AST/IU·L－1 MDA/μmol·g－1Pro SOD/kU· g－1Pro IFN-γ/μg·g－1Pro TNF-α/μg·g－1±10.1 0.31 ±0.07 0.43 ±0.11 Model - 171.0 ±27.0* 186.6 ±16.6* 6.53 ±0.21* 50.5 ±5.68* 0.78 ±0.31* 0.98 ±0.13*TPF 200 135.1 ±13.7# 77.6 ±23.1# 2.25 ±0.57# 70.5 ±7.34# 0.46 ±0.10# 0.52 ±0.18#100 153.0 ±11.6# 97.2 ±12.8# 2.35 ±0.87# 68.7 ±8.56# 0.60 ±0.26# 0.66 ±0.07#50 158.8 ±7.42# 113.7 ±6.60# 2.71 ±0.45# 64.3 ±7.82# 0.73 ±0.30# 0.72 ±0.05#BF 200 154.6 ±12.5# 96.5 ±15.1# 2.10 ±0.68# 67.4 ±8.72# 0.42 ±0.20# 0.64 ±0.15#

2.2TPF对Con A致免疫性肝损伤小鼠肝脏病理组织学的影响光镜下可见，正常组小鼠肝组织结构清晰，肝小叶结构完整，中央静脉周围肝窦呈放射状发散，汇管区未见炎细胞浸润。模型组肝细胞肿胀，点状变性坏死，散在脂肪滴。联苯双酯组和TPF高、中剂量组肝细胞肿胀较模型组减轻，炎细胞浸润减少，肝细胞损伤程度减轻。

3 讨论

目前，小鼠免疫性肝损伤的模型主要有卡介苗加脂多糖诱导、丙酸杆菌或痤疮丙酸杆菌加脂多糖诱导以及Con A诱导等［3］。Con A诱发的小鼠急性肝损伤是筛选治疗急性肝炎和暴发性肝衰竭药物的较理想的动物模型［4］。本研究结果显示，TPF各剂量组能降低小鼠血清中ALT、AST和升高肝匀浆中MDA水平，增强肝匀浆中重要的抗氧化酶SOD的活性，减轻肝脏的病理性损伤，表明TPF对Con A诱导的小鼠免疫性肝损伤具有保护作用。

Con A活化Th细胞后刺激Th细胞和巨噬细胞产生过量的IFN-γ、TNF-α 等细胞因子，其中 TNF-α 可激活核因子 κB诱导的TNF-α、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及IFN－γ等细胞因子的转录，在Con A诱导的肝损伤中起主要介导作用，急性肝损伤时，血清中TNF-α含量升高。高水平TNF-α是引起肝细胞坏死的一种重要细胞因子，既可诱导肝细胞凋亡，也可以导致肝细胞坏死［5］。IFN-γ可介导 T细胞对巨噬细胞的激活，促进静止的CD4+T细胞转变为Th1细胞［6］，刺激巨噬细胞产生过量的TNF-α和IFN-γ，加速肝细胞的坏死。TPF各剂量组能明显降低小鼠肝匀浆中 IFN-γ、TNF-α水平，因此，其对Con A诱导的小鼠免疫性肝损伤的保护作用机制可能与抗氧化和抑制细胞因子IFN-γ、TNF-α等表达有关。

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