人肝微粒体中CYP3A4对氯胺酮代谢的催化作用

赵芸慧，田阿勇，马 虹，王俊科

(中国医科大学附属第一医院麻醉科，辽宁沈阳 110001)

氯胺酮(ketamine)是临床常用静脉麻醉药，特别是广泛用于小儿短小手术的麻醉和术前基础麻醉。已知氯胺酮进入体内之后，大部分经肝脏细胞色素P450代谢，形成去甲氯胺酮。有必要进一步研究氯胺酮的代谢机制和影响其代谢的遗传机制。

1 材料与方法

1.1一般资料本研究进行人体组织实验已获得中国医科大学伦理委员会的批准。20例人体肝脏组织来自中国医科大学附属第一医院普外科肝脏部分切除手术，患者(8男，12女)的平均年龄为(49±12)岁，并已排除急慢性肝炎、肝硬化和长期吸烟酗酒史病例。取直径为1～2 cm的正常肝脏组织(经病理形态学证实)，10 min内液氮冰冻，－70℃冰箱保存备用。肝脏微粒体通过差速离心法制备，所有试剂及器械均需冰盒内预冷。

1.2孵育条件孵育混合液包括400mg·L－1微粒体稀释液，100 mmol·L－1磷酸钾缓冲液(pH 7.4)和在聚乙烯试管中孵育过的0.5 ml底物，37℃水浴摇床先预孵育3min，反应从加入1 mmol·L－1NADPH 辅酶再生系统(0.5 mmol·L－1NADP+，5 mmol·L－1G6P，2 000 U·L－1G6PDH，6 mmol·L－1MgCl2)开始，分别孵育 0、5、10、20、40、60 min。各管中加入1 ml 0.1 mol·L－1的冷NaOH放入－20℃冰箱中止反应。每个样本重复实验3次

1.3样品处理加入10 μl内标布比卡因混匀，加入750 μl乙腈沉淀蛋白，振荡混匀，10 800×g离心10 min，取上清50 μl进样。采用高效液相色谱法(HPLC)测定各时点氯胺酮的浓度。与CYP3A4的特异底物硝苯地平(nifedipine)和抑制剂孕二烯酮(gestodene)作相关分析。荧光检测波长为211 nm，流速 1 ml·min－1，流动相 ∶乙腈 ∶0.025 mol·L－1KH2PO4∶三乙胺(40 ∶60 ∶0.02)。

1.4氯胺酮及硝苯地平代谢速率的测定肝脏微粒体中氯胺酮的代谢速率可通过下面公式计算，其中C为氯胺酮在孵育液中的初始浓度为氯胺酮在孵育液中的消除半衰期:消除速度r=C×0.693/氯胺酮消除半衰期是从各时间点氯胺酮剩余浓度的均值对时间作半对数图形进行线性相关分析计算而得。

1.5抑制性研究应用CYP3A4特异性抑制剂孕二烯酮对微粒体中氯胺酮的代谢进行抑制性研究。这些抑制剂溶解在甲醇溶液当中，在孵育反应开始前，10 μmol·L－1孕二烯酮 20 μl分别与 400 mg·L－1肝微粒体和0.05 mmol·L－1氯胺酮在磷酸缓冲液当中预孵育3 min，反应从加入NADPH(1 mmol·L－1)工作液开始持续60 min，其余步骤同前述。

1.6统计学处理采用SPSS11.5统计分析软件进行统计学分析，所有数据以±s表示。氯胺酮的代谢速率与加入特异性底物硝苯地平的代谢速率行相关性分析，氯胺酮代谢速率与加入特异性抑制剂孕二烯酮后的代谢速率比较采用配对t检验。

2 结果

20例人肝脏微粒体中氯胺酮的代谢速率相差最大约1倍，平均为(12.6±3.8)μmol·min－1·g－1protein。该速率与CYP3A4活性探针硝苯地平代谢速率呈正相关(r=0.917，P＜0.01)。加入特异性抑制剂组，氯胺酮的平均代谢速率都明显低于正常孵育组(P＜0.01)，为(4.7±1.6)μmol·min－1·g－1protein，抑制率为62.7%。

3 讨论

实验结果表明，氯胺酮在微粒体孵育液的代谢速率和CYP3A4的活性探针硝苯地平的代谢速率呈明显正相关;CYP3A4酶活性特异性抑制剂孕二烯酮对氯胺酮在微粒体孵育液的代谢速率有明显的抑制作用;CYP3A4对氯胺酮的代谢具有催化作用;适用于药物体外代谢速率的研究。

在人类 P450家庭中，主要有 3族(CYP1、CYP2、CPY3)19种同工酶参与外来化学物的代谢［1］。CYP 1，2，3 家族约占肝 P450 总含量的70%，并负责大多数药物的代谢。已知CYP2B6、CYP3A4、CYP2C9三种酶在肝微粒体中均具有较高活性［2－3］，遗传多态性、酶抑制、酶诱导及生理因素均可引起细胞色素P450活性的改变，有一定的临床意义。因为这会引起药物药代动力学的改变，导致药物效应改变，因代谢减少或毒性代谢物生成增多而增加药物毒性，以及导致药物的相互作用。Hijazi等［4］认为人肝脏微粒体中氯胺酮的代谢主要是由CYP2B6催化。而 Hijazi等［5］的研究指出 P450 CYP2B6、CYP3A4、CYP2C9三种酶同时代谢氯胺酮，CYP3A4占主导地位，CYP2B6仅占很小一部分。Mssner等［6］发现 CYP3A4、CYP 2B6、CYP 2C9 的抑制剂都降低了氯胺酮的代谢，CYP3A4的抑制剂对氯胺酮的代谢抑制作用最强。究竟有几种P450酶参与氯胺酮的代谢和哪一种酶起到决定性作用目前还没有定论，有待于进一步的研究。本研究的结果提示CYP3A4参与了氯胺酮的代谢，CYP3A4特异性抑制剂孕二烯酮抑制了氯胺酮的代谢，和国外相关文献报道的结果是一致的［4－6］。

CYP3A4是人体含量最丰富的P450酶，大约占人肝P450总含量的30% ，参与市场上50% 以上的药物代谢［7］。在CYP3A亚家族中，对CYP3A4的研究较多。CYP 3A4参与一系列临床治疗药的代谢，包括抗心律失常药、钙通道阻滞剂、三环类抗抑郁药(tricyclic antidepressants)及5-羟色胺再摄取抑制剂(selective serotomin reuptake inhibitors)、环孢霉素、氯氮平、苯二氮卓类、大环内酯类抗生素、糖皮质激素及孕(雌)激素、吡喹酮、卡马西平、醋氨酚等及某些致癌物等［8］。上述许多药物的疗效及不良反应与体内药物浓度密切相关，而CYP3A4的活性亦存在个体差异，了解患者体内CYP3A4活性，对合理应用这些药物会有一定的帮助。

CYP3A4基因位于人类第7号染色体q21.1，基因全长分别为27.2 kb，有13个外显子，编码502个氨基酸，CYP3A4的活性与CYP3A mRNA的表达量呈正相关，表明影响CYP3A4表达主要是转录水平的调控，CYP3A5活性的差异主要是由单核苷酸的多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)造成的［9］。CYP3A4 SNPs研究表明个体间 CYP3A4活性的差异85%是由遗传因素决定，探寻CYP3A4基因变异也成为诠释酶活性差异的另外一个研究热点［10］。

随着CYP3A4分子药理学的深入研究，将从基因水平阐述CYP3A4的表达调控机制及其个体差异性的产生机制［11－12］。

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