吸烟2型糖尿病大鼠葡萄糖转运子4的表达

王晓蕾 时艺珊 鞠 巍

（沈阳医学院沈洲医院内分泌科，辽宁 沈阳 110002）

目前，糖尿病和糖尿病前期在中国普通成年人群中高度流行，严重危害人民身体健康[1]。2007年中国糖尿病患者人数已达3980万，预计2025年将达到5930万[1]。对糖尿病易患因素及其发病机制的研究已经引起学者们的广泛关注。目前认为，吸烟是导致人群多种疾病发生发展和死亡的重要影响因素。已有研究表明，吸烟与糖尿病（尤其2型糖尿病）的发病有明确关系[2]。本研究通过观察吸烟2型糖尿病大鼠肌肉组织中葡萄糖转运子4（glucose transporter 4，GLUT4）的表达情况，分析吸烟对2型糖尿病发病的影响。

表1 第8周及第12周时三组指标比较（±s）

注：1）与8周正常对照组相比，差别有统计学意义，P＜0.05；2）与8周2型糖尿病非吸烟组相比，差别有统计学意义，P＜0.05；3）与8周2型糖尿病吸烟组相比，差别有统计学意义，P＜0.05；4）与12周正常对照组相比，差别有统计学意义，P＜0.05；5）与12周2型糖尿病非吸烟组相比，差别有统计学意义，P＜0.05

2型糖尿病吸烟组12周（n=20）空腹血糖（mmol/L） 5.00±0.02 9.48±0.071） 9.26±0.091） 5.03±0.03 9.22±0.041）4） 11.01±0.111）2）3）4）5）空腹胰岛素（mU/L） 8.84±0.27 20.36±3.021） 19.77±2.681） 9.44±1.34 21.13±2.171）4） 25.65±3.531）2）3）4）5）胰岛素抵抗指数 2.16±0.04 7.95±0.281） 7.92±1.211） 2.25±0.08 8.04±0.281）4） 12.53±1.561）2）3）4）5）GHbA1c（%） 4.29±0.34 8.01±0.241） 7.85±0.311） 4.76±0.32 8.12±0.421）4） 8.34±0.461）4）TC（mmol/L） 1.08±0.06 1.70±0.071） 1.69±0.121） 1.10±0.06 1.73±0.101）4） 1.79±0.031）4）TG（mmol/L） 0.48±0.05 1.21±0.071） 1.29±0.131） 0.56±0.02 1.31±0.111）4） 1.35±0.091）4）LDL-C（mmol/L） 0.45±0.03 0.76±0.041） 0.72±0.051） 0.48±0.01 0.81±0.041）4） 1.16±0.061）2）3）4）5）HDL-C（mmol/L） 0.98±0.01 0.76±0.06 0.79±0.05 0.86±0.04 0.68±0.051）4） 0.67±0.021）4）指标 正常对照组8周（n=20）2型糖尿病非吸烟组8周（n=20）2型糖尿病吸烟组8周（n=20）正常对照组12周（n=20）2型糖尿病非吸烟组12周（n=20）

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组

取60只Wistar大鼠（购自中国医科大学），8周龄，雄性，清洁级。体质量130~200g。去除体重差异较大的大鼠，随机分配为3组。①正常对照组20只。②2型糖尿病非吸烟组20只。③2型糖尿病吸烟组20只。

1.1.2 主要设备及试剂

颗粒饲料（购自中国医科大学）；高糖高脂饲料（自配）；链脲佐菌素（streptoztocin, STZ，美国Sigma公司）；香烟为市售X牌香烟，尼古丁含量1mg/支，焦油含量18mg/支。RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒及RT-PCR试剂盒（美国Ambion公司）。引物由大连宝生物工程有限公司合成。日立7170全自动生化仪（日本日立公司）；PCR仪（德国Biometra公司）；Chemi Imager 5500凝胶图像系统（美国Alpha Innotech公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立

①确定胰岛素抵抗动物模型：三组大鼠均每笼3~4只，饲养7周，室温21~26℃，湿度50~60ºC，12h光照周期，动物室内每天清扫消毒。正常对照组予普通饲料喂养，2型糖尿病吸烟组及2型糖尿病非吸烟组给予高糖高脂饲料喂养。饮水为纯净水。三组均喂养7周。②小剂量STZ静脉注射诱导2型糖尿病模型[3]：2型糖尿病吸烟组及2型糖尿病非吸烟组大鼠尾静脉注射STZ 15 mg/kg（以pH值4.5的0.1 mmol/L枸橼酸钠缓冲液配成0.3%浓度），对照组仅注射枸橼酸钠缓冲液。三组继续原饲料喂养1周后检测血糖及胰岛素等指标，根据随机血糖＞16.7 mmol/L确定2型糖尿病动物模型[4]，2型糖尿病吸烟组及2型糖尿病非吸烟组共40只大鼠均造模成功。③将2型糖尿病吸烟组大鼠20只关进自制“被动吸烟箱”内。箱上方有通风口与外界相通，侧壁有与香烟直径相通的孔，点燃的香烟烟雾由侧壁孔扩散至整个箱内。大鼠在此环境中吸烟，每天吸烟2次，两次间隔4h，每次30min。2型糖尿病非吸烟组及对照组大鼠同时也被关进“吸烟箱”，相同时间，不输入香烟烟雾。共4周后检测三组血糖及胰岛素等指标进行比较。整个实验过程中各组大鼠均无死亡。

1.2.2 指标测定

空腹血糖及胰岛素、糖化血红蛋白、血脂检查均为禁食水12h后尾静脉采血测定。①血糖测定：第8周、第12周各测一次空腹血糖。②第8周、第12周各测一次空腹胰岛素水平。计算胰岛素抵抗指数。胰岛素抵抗指数=空腹血浆血糖（mmol/L）×空腹血清胰岛素（mU/L）/22.5[5]。③第8周、第12周各测一次糖化血红蛋白（glycated hemoglobin A1c，GHbA1c）。④第8周、第12周各测一次血脂，包括血清总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterin，LDL-C）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein cholesterin，HDL-C）。

1.2.3 PCR法检测GLUT4的表达

实验12周时三组大鼠均处死。①取骨骼肌组织冷冻保存。②应用RNA提取液提取总RNA。按试剂盒说明合成cDNA。③设计GLUT4正向和反向引物：上游5'-GCGTGGGTTTCGTGCTTT-3'，下游5'-GGTAGTTCCCGATGGCTC-3'，扩增产物片断长度为154 bp。④按试剂盒操作规程进行竞争性RT-PCR反应。采用竞争性引物混合物（primer∶competimer 比例 2∶8），在扩增目标基因的同时扩增rRNA（489 bp）作为内对照。PCR循环扩增条件为94ºC预热3min，94ºC变性30s，56ºC退火30s，72ºC延伸60s。循环30个周期后72ºC延伸4min。⑤2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色。紫外灯下观察, 拍照。应用密度测定系统测定分析电泳带的密度。

1.3 统计学分析

数据统计应用SPSS17.0软件对数据进行统计处理，数据以（±s）表示。多组间均数比较采用单因素方差分析，两组间均数采用T检验，单因素相关分析应用Pearson相关分析，P＜0.05有统计学差异。

2 结 果

2.1 第8周2型糖尿病造模成功，2型糖尿病吸烟组及2型糖尿病非吸烟组空腹血糖及胰岛素水平、胰岛素抵抗指数、GHbA1c、TC、TG、LDL-C均明显高于对照组，结果有统计学意义，P＜0.05。第12周2型糖尿病吸烟组及2型糖尿病非吸烟组空腹血糖及胰岛素水平、胰岛素抵抗指数、GHbA1c、TC、TG、LDL-C均明显高于对照组，HDL-C明显低于对照组结果有统计学意义，P＜0.05；2型糖尿病吸烟组空腹血糖及胰岛素水平、胰岛素抵抗指数、LDL-C水平均明显高于2型糖尿病非吸烟组，结果有统计学意义，P＜0.05（表1）。

2.2 第12周时取三组大鼠骨骼肌组织，PCR法检测GLUT4表达。2型糖尿病吸烟组及2型糖尿病非吸烟组GLUT4表达均明显低于对照组，2型糖尿病吸烟组GLUT4表达明显低于2型糖尿病非吸烟组。2型糖尿病非吸烟组较对照组下调3.4倍，2型糖尿病吸烟组较对照组下调9.8倍，结果有统计学意义，P＜0.05。GLUT4表达与三组胰岛素抵抗指数水平呈显著负相关（相关系数为–0.825，P＜0.01）。（见表2及图1）。

表2 第12周时三组胰岛素抵抗指数及GLUT4比较（±s）

表2 第12周时三组胰岛素抵抗指数及GLUT4比较（±s）

注：1）与正常对照组相比，差别有统计学意义，P＜0.05；2）与2型糖尿病非吸烟组相比，差别有统计学意义，P＜0.05

2型糖尿病吸烟组（n=20）胰岛素抵抗指数 2.25±0.08 8.04±0.281） 12.53±1.561）2）GLUT4 1.45±0.02 0.43±0.021） 0.15±0.011）2）指标 正常对照组（n=20）2型糖尿病非吸烟组（n=20）

图1 第12周时三组大鼠骨骼肌组织GLUT4表达比较

3 讨 论

世界范围内，吸烟是人类的一个重要死亡原因[6]。吸烟与肿瘤、心脑血管疾病、糖尿病等疾病发病均有重要关系[7,8]。流行病学调查显示，戒烟成功可降低人群病死率，但既往吸烟史所带来的不良影响仍会持续数年，糖尿病患者表现更为突出[8]。

吸烟通过多种机制影响糖尿病的发生发展，包括胰岛素抵抗、胰岛β细胞损伤等，其中胰岛素抵抗为其主要方面[9]，而胰岛素抵抗是2型糖尿病的重要发病机制。本研究通过高糖高脂饲料喂养及静脉注射STZ诱导方法成功制备出2型糖尿病大鼠模型，并通过计算胰岛素抵抗指数对其胰岛素抵抗程度进行评价。而后将2型糖尿病吸烟组大鼠置于吸烟箱内继续观察。研究发现，试验12周时吸烟2型糖尿病大鼠的空腹血糖及胰岛素水平均明显高于2型糖尿病非吸烟组和对照组，胰岛素抵抗指数明显增高，说明吸烟确实能够加重胰岛素抵抗，促进2型糖尿病的发生发展。

胰岛素抵抗主要表现为外周组织对葡萄糖的摄取利用下降。吸烟可通过多种途径加重胰岛素抵抗，包括脂代谢紊乱及肥胖；血管内膜损伤；胰岛素受体敏感性受损等[10]。同时，尼古丁还可以通过兴奋交感神经系统进而妨碍葡萄糖转运[10]。葡萄糖转运能力是葡萄糖利用的关键步骤，葡萄糖转运系统的损伤可以导致胰岛素抵抗[11]。本研究中第12周时取三组大鼠骨骼肌组织，PCR法检测GLUT4表达。2型糖尿病吸烟组及2型糖尿病非吸烟组GLUT4表达均明显低于对照组，而2型糖尿病吸烟组较2型糖尿病非吸烟组GLUT4表达减低更加明显，且与三组胰岛素抵抗指数水平呈显著负相关，说明骨骼肌组织中GLUT4的表达与胰岛素抵抗及2型糖尿病的发生发展密切相关。GLUT4是一种跨膜转运蛋白，广泛分布于对胰岛素敏感的骨骼肌、心肌、脂肪及肾小球系膜细胞、入球小动脉平滑肌段的上皮细胞等细胞中[12,13]。研究表明，GLUT4在葡萄糖转运的过程中起着重要作用[14]，其表达水平与骨骼肌、脂肪组织等的胰岛素抵抗情况密切相关，可影响2型糖尿病的发生和发展[15]。而本研究提示，长期吸烟可能通过减低骨骼肌组织中GLUT4的表达水平增加胰岛素抵抗，促进2型糖尿病的进展。

通过本试验研究我们得出结论，吸烟可通过降低骨骼肌GLUT4的表达增加胰岛素抵抗，促进2型糖尿病的发生和发展，危害人类健康。因此，我们积极倡导广泛戒烟，养成良好生活方式，对早期预防2型糖尿病具有积极意义。

[1]Yang SH,Dou KF,Song WJ.Prevalence of diabetes among men and women in China[J].N Engl J Med,2010,362(25):2425-2426.

[2]Sairenchi T,Iso H,Nishimura A,et al.Cigarette smoking and risk of type 2 diabetes mellitus among middle-aged and elderly Japanese men and women[J].Epidemiol,2004,160(2):158-162.

[3]Amin KA,Awad EM,Nagy MA.Effects of panax quinquefolium on streptozotocin-induced diabetic rats: role of C-peptide,nitric oxide and oxidative stress[J].Int J Clin Exp Med,2011,4(2):136-147.

[4]Park SH,Bahk JH,Oh AY,et al.Gender difference and change of α(1)-adrenoceptors in the distal mesenteric arteries of streptozotocininduced diabetic rats[J].Korean J Anesthesiol,2011,61(5):419-427.

[5]Zadeh-Vakili A,Ramezani Tehrani F,Hosseinpanah F.Waist circumference and insulin resistance: a community based cross sectional study on reproductive aged Iranian women[J].Diabetol Metab Syndr,2011,3(1):18.

[6]Karter AJ,Stevens MR,Gregg EW,et al.Educational disparities in rates of smoking among diabetic adults: the translating research into action for diabetes study[J].Am j public health,2008,98(2):365-370.

[7]Park SL,Bastani D,Goldstein BY,et al.Associations between NBS1 polymorphisms,haplotypes and smoking-related cancers[J].Carcin ogenesis,2010,31(7):1264-1271.

[8]Yeh HC,Duncan BB,Schmidt MI,et al.Smoking,smoking cessation,and risk for type 2 diabetes mellitus: a cohort study[J].Ann Intern Med,2010,152(1):10-17.

[9]Anan F,Takahashi N,Shinohara T,et al.Smoking is associated with insulin resistance and cardiovascular autonomic dysfunction in type 2 diabetic patients[J].Eur J Clin Invest,1992,42(5):1086-1092.

[10]Xie XT,Liu Q,Wu J,et al.Impact of cigarette smoking in type 2 diabetes development[J].Acta Pharmacol Sin,2009,30(6):784-787.

[11]Garvey WT,Birnbaum M.Cellular insulin action and insulin resistance[J].Baillieres Clin Endocrinol Metab,1993,7(4):785-873.

[12]Desrois M,Sidell RJ,Gauguier D,et al.Initial steps of insulin signaling and glucose transport are defective in the type 2 diabetic rat heart[J].Cardiovasc Res,2005,289(4):E551-561.

[13]Briggs JP,Marcus RG,Barac-Nieto M,et al.Insulin-responsive glucose transporter expression in renal microvessels and glomeruli[J].Kidney Int,1992,42(5):1086-1092.

[14]Lauro D,Kido Y,Castle AL,et al.Impaired glucose tolerance in mice with a targeted impairment of insulin action in muscle and adipose tissue[J].Nat Genet,1998,20(3):294-298.

[15]Michelle FL,Poon V,Klip A.GLUT4 activation: thoughts on possible mechanisms[J].Acta Physiol Scand,2003,178(4):287-296.