胎球蛋白－a对3T3－L1脂肪细胞脂肪分解的影响

冯娜娜，陶 婷

（上海交通大学医学院附属瑞金医院 老年病科，上海 200025）

脂肪分解是人体能量代谢的核心反应之一。当机体有能量需求时，甘油三酯在特异性的脂肪酶的作用下分解为甘油和脂肪酸为机体提供能量。如果人体脂肪分解出现障碍，就会影响机体能量的平衡进而引发肥胖和胰岛素抵抗等疾病。Fetuin－a是存在于正常哺乳动物血清中的一种糖蛋白，是胰岛素受体酪氨酸激酶天然的抑制剂［1］。人的fetuin－a基因位于3号染色体q27位点上，该位点与代谢方面疾病密切相关［2］。Mathews ST等研究发现，fetuina基因敲除的小鼠能够抵抗高脂饮食引起的肥胖［3］；而临床研究表明体内fetuin－a的升高与肥胖发生密切相关［4］。但目前fetuin－a与肥胖相关的分子机制尚并不清楚。本研究旨在探讨fetuin－a对3T3－L1脂肪细胞脂肪分解的影响及其可能的分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料

3T3－L1前脂肪细胞株购自美国ATCC，牛血清胎球蛋白（fetuin－a）购自 Calbiochem 公司；高糖DMEM培养基购自美国GIBCO公司；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）购自PAA Laboratories Gmb H公司；地塞米松购自Merck公司；甘油检测试剂盒、甘油标准品、1－甲基－3－异丁基黄嘌呤（IBMX）购自Sigma公司；Trizol购自Invitrogen公司；Oligo（d T）Primer、d NTP、M－MLV 逆转录酶、Taq DNA聚合酶为Promega公司产品；Real－time PCR试剂盒购自Takara公司；引物由Invitrogen公司合成；Phospho－HSL（Ser563）、ATGL、β－actin抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；HRP标记的二抗购自Santa Cruz公司；CAMP ELISA试剂盒购自R＆D公司。

1.2 方法

1.2.1 3T3－L1前脂肪细胞的培养与诱导分化3T3－L1前脂肪细胞用含10%FBS的高糖DMEM培养基在37℃，5%CO2条件下培养。细胞汇合后2 d，加入诱导液 A（10%FBS高糖 DMEM，含0.5 m M IBMX、1μM 地塞米松、10μg／ml胰岛素）开始诱导。2天后，换成诱导液B（10%FBS高糖DMEM含10μg／ml胰岛素）。2天后重新换10%FBS高糖DMEM继续培养，隔天换液一次。诱导分化8天，细胞90%以上呈成熟脂肪细胞表型，可用于实验。

1.2.2 甘油含量测定 分化成熟的脂肪细胞，以含0.2%牛血清白蛋白的DMEM孵育过夜，PBS洗3遍，加入含有不同浓度（0、0.2、1、5、40μM）的fetuin－a孵育12 h。用甘油检测试剂盒测定各处理组培养液中的甘油浓度作为脂解率的指标，操作方法严格按照甘油检测试剂盒说明书执行。

1.2.3 Real－time PCR测定 ATGL m RNA 的表达细胞分化成熟后用不同浓度（0、0.2、1、5、40μM）的fetuin－a孵育12 h后，用Trizol试剂提取脂肪细胞总RNA。定量后取总RNA 2μg，以Oligo（d T）为引物进行逆转录反应，反应体系为25μl。按SYBR green PCR master mix试剂盒的说明书进行定量PCR扩增和检测，所用ATGL引物序列为：上游引物：5’－CGTCACCTGTGCCTTACTC－3’，下游引 物：5’－GGGCTCAAACTCCCAAAC－3’。 用 βactin作为内参校正，采用相对定量方式表示各样本目的基因的表达。实验均重复3次。

1.2.4 Western blot测定 HSL、ATGL蛋白表达细胞分化成熟后用不同浓度（0、0.2、1、5、40μM）的fetuin－a孵育12 h后，PBS洗3遍，再用蛋白提取裂解液裂解细胞，13 000×g离心20 min，吸取上清进行蛋白定量。取50μg样品进行SDS－PAGE蛋白电泳，通过电泳仪将蛋白转移至硝酸纤维素膜，以5%脱脂奶粉封闭1 h，再用5%脱脂奶粉稀释一抗4℃杂交过夜，TBST（20 mmol／L Tris·HCl，p H 7.6；150 mmol／L NaCl；0.1%Tween20）洗3次，每次10 min；5%脱脂奶粉稀释二抗，孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min；最后以化学发光法（ECL）显影。ImageJ分析电泳条带密度值，目的蛋白表达水平以该条带密度占β－actin条带密度的百分比（%）表示。

1.2.5 c AMP浓度检测 分化成熟的细胞用不同浓度（0、0.2、1、5、40μM）fetuin－a孵育12 h后，弃掉上清，PBS洗3遍，加入细胞裂解液裂解细胞后，按照c AMP ELISA检测试剂盒说明书对细胞内c AMP进行检测。测得的结果用总蛋白校正，数值以c AMP pmol／mg protein表示。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 Fetuin－a抑制3T3－L1脂肪细胞基础状态下的脂肪分解

根据同类研究和本研究预试验的结果，12 h是fetuin－a抑制脂肪细胞基础脂肪分解的有效时间点。分化成熟的脂肪细胞用不同浓度（0、0.2、1、5、40 μM）fetuin－a孵育12 h后，测定培养液中的甘油释放量作为脂解率的指标。如图1所示，随着fetuin－a浓度的增加，脂肪细胞的甘油释放显著降低，并具有剂量依赖关系（P＜0.05）。其中40μM fetuin－a作用最显著，能使脂肪分解下降约61%。

2.2 Fetuin－a对ATGL mRNA表达的影响

分化成熟的脂肪细胞用不同浓度（0、0.2、1、5、40μM）fetuin－a孵育12 h后，提取总 RNA，采用Real－time PCR法检测目的基因的mRNA的表达。如图2所示，与对照组相比fetuin－a能显著抑制ATGL的 mRNA表达（P＜0.05）。

2.3 Fetuin－a对脂肪分解相关酶 HSL、ATGL蛋白表达的影响

分化成熟的脂肪细胞用不同浓度（0、0.2、1、5、40μM）fetuin－a孵育12 h后，提取细胞总蛋白，采用Western blot法检测目的基因的蛋白表达。如图3所示，与对照组相比fetuin－a能显著抑制 HSL、ATGL的蛋白表达（P＜0.05，P＜0.05）。

2.4 Fetuin－a对细胞内cAMP含量的影响

为了了解fetuin－a影响脂肪分解的可能机制，我们检测了脂肪分解的经典传导通路－c AMP依赖的PKA通路。ELISA检测结果显示，fetuin－a作用12 h，能够显著降低细胞内c AMP的含量，并呈剂量依赖关系（P＜0.05，见图4）。40μM fetuin－a使细胞内c AMP的含量下降最显著，34%左右。

3 讨论

图1 Fetuin－a对3T3－L1脂肪细胞脂肪分解的影响

图2 Fetuin－a对3T3－L1脂肪细胞ATGL mRNA表达的影响

本实验的主要目的在于研究fetuin－a对脂肪分解的影响及其机制。Fetuin－a是存在于正常哺乳动物血清中的一种糖蛋白，其最初从牛血清中分离提纯获得，胚胎期可由肝脏、胰脏、肾脏等多种组织器官合成分泌，成年后则主要由肝脏合成分泌入血清［5］。人的fetuin－a基因位于3号染色体q27位点上，该位点与代谢方面疾病密切相关［2］。在饮食诱导的肥胖小鼠的动物实验中，与对照组比较肥胖小鼠血清fetuin－a的含量明显增加。Fetuin－a敲除的小鼠给予高脂饮食时，与正常小鼠比较脂肪沉积明显减少并能抵抗由此引起的肥胖［3］。临床研究发现，fetuin－a升高与内脏脂肪沉积有关［6］。病人在体重减轻后，血清中fetuin－a也明显降低［7］。Chen HY等人发现在非糖尿病血透病人中，血清中fetuin－a水平最高组躯干肥胖的发生率是最低组的3.2倍［4］。以上研究提示fetuin－a与肥胖有关。脂肪分解异常会导致肥胖，皮下脂肪组织中儿茶酚胺诱导的脂肪分解受损是肥胖患者的一个常见特征［8，9］。本研究通过测定细胞培养液中的甘油释放量证实fetuin－a以剂量依赖的方式抑制脂肪细胞的脂肪分解，表明fetuin－a是脂肪分解的重要的抑制因子。

图3 Fetuin－a对3T3－L1脂肪细胞phospho－HSL和ATGL蛋白表达的影响

图4 Fetuin－a对3T3－L1脂肪细胞内cAMP含量的影响

HSL是经典的脂肪分解反应限速酶，其表达水平降低及活性减弱均会导致机体脂肪分解率下降。机体通过c AMP－PKA通路调节 HSL的活性，c AMP是该信号通路中的重要的第二信使。在激素的作用下Gs偶联的受体被激活，从而激活c AMP，导致细胞内c AMP水平增加，进而激活PKA。PKA使HSL磷酸化，磷酸化的HSL从胞浆向脂滴表面转位从而分解脂滴内甘油三酯［10］。本实验通过western blot检测细胞内磷酸化HSL的含量，通过ELISA检测检测细胞中c AMP的含量。结果表明，fetuin－a能够降低细胞内c AMP及磷酸化HSL的含量。据此推测，fetuin－a通过降低细胞中c AMP的含量，抑制了细胞中HSL的磷酸化过程，从而抑制了脂肪细胞的脂肪分解。

ATGL是体内脂肪分解的另一种限速酶，已证实ATGL主要水解甘油三酯为甘油二酯，其与HSL共同提供体内大约95%的脂肪水解活性［11］。其表达水平降低同样会导致机体脂肪分解率下降。本实验发现fetuin－a能够明显降低细胞内ATGL m RNA及蛋白的表达，推测这与fetuin－a抑制脂肪分解相关。

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