EPO对心肺复苏后大鼠海马神经元的细胞凋亡、Bcl－2及Bax表达的影响

孙晓佳，孙 宇，孙 霓，王胜军，李秀江＊

（1.吉林大学第一医院 重症监护科，吉林 长春 130021；2.吉林省肿瘤医院 重症监护科，吉林 长春 130012）

随着心肺复苏术的发展国内外文献报道心肺复苏成功率有所提高，但脑复苏率未见明显提高。其根源在于脑组织未能及时得到保护治疗。因此，心肺复苏是决定预后的基础，脑复苏则是决定预后的关键。究其机制与缺血缺氧及再灌注损伤与神经存活信号转导通路及神经元的凋亡有密切关系。文献报道EPO对神经细胞具有营养和抗凋亡的双重作用，但其作用机制仍未完全明了。国内尚无从心肺复苏角度探讨EPO的抗神经细胞凋亡机制的研究，本实验观察EPO对心肺复苏术后大鼠海马神经细胞凋亡、Bcl－2及Bax表达的影响，以探讨心肺复苏后神经元损伤及促红细胞生成素的保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

健康Wistar雄性大鼠32只，无菌级，体重220－270 g，由吉林大学实验动物部提供。饲料为繁育鼠全价固体颗粒饲料，吉林大学实验动物部提供。EPO沈阳三生制药股份公司提供。原位末端标记检测（TUNEL）试剂盒、Bcl－2兔多克隆抗体、Bax鼠单克隆抗体购于SantaCurz公司，SABC试剂盒及DAB显色试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。水合氯醛、PBS及其它试剂均为国产分析纯级。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及动物模型制作 健康Wistar雄性大鼠32只，随机分4组，每组8只。正常对照组（A组）、假手术组（B组）、心肺复苏模型组（C组）、EPO干预组（D组）。腹腔注射10%水合氯醛麻醉（300 mg／kg）后，分离并切开气管，行气管插管术连接动物呼吸机，设置容量控制模式，呼吸频率70次／min，潮气量8 ml／kg；分离右侧颈总动脉，插导管，连接多导生理仪用Pclab软件传导并监测血压、心电图；分离左侧颈总静脉留置输液管。A组不给予任何处置。C、D组手术操作完成后，稳定10 min，然后在呼气末夹闭气管使大鼠窒息7－9 min，在当大鼠收缩压≤30 mm Hg并出现心脏停搏时［1］，立即开放呼吸机，吸入100%纯氧，胸外按压，当大鼠出现自主心律、脉搏波、收缩压≥60 mm Hg，并持续10 min以上判定为自主循环恢复（re－turn of spontaneous circultion，ROSC），必要时予肾上腺素或多巴胺协同复苏。C组心肺复苏同时给予EPO 3000U／kg左侧颈总静脉注射。B组仅给予等剂量生理盐水左侧颈总静脉注射。

1.2.2 标本采集与组织学检查 4 h后给予全部存活大鼠10%水合氯醛过量麻醉，用37℃生理盐水250 ml经心脏灌注快速冲洗去除血细胞，再用4℃多聚甲醛250 ml灌注固定后断头取脑，经4%多聚甲醛后固定24－48 h后，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜观察组织学变化。

1.2.3 原位细胞凋亡检测 步骤：①标本切片常规脱蜡水化；②配制新鲜3%H2O2室温孵育10 min；③稀释新鲜Proteinase K37℃消化10 min；④加标记液，37℃标记2h；⑤加封闭液室温30 min；⑥加生物素化抗地高辛抗体37℃反应30 min；⑦加SABC，37℃反应30 min；⑧DAB显色；⑨苏木素轻度复染，脱水、封片，显微镜下观察。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。每张切片取5个高倍镜视野（400×）计数，取平均值，为该切片凋亡细胞数。

1.2.4 Bcl－2、Bax免疫组织染色 步骤：①标本切片常规脱蜡水化；②3%H2O2室温孵育15 min灭活内源性过氧化物酶；③0.1%TBS中行微波抗原修复10 min；④正常山羊血清室温孵育15 min，封闭非特异性抗原；⑤滴加滴加一抗，（1∶100），4℃过夜；⑥滴加生物标记二抗37℃孵育20 min；⑦滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素37℃孵育20 min；⑧DAB显色；⑨水洗、复染、封片、光镜下观察。空白对照实验用PBS代替抗体。Bcl－2阳性细胞胞浆／胞膜被染成棕黄色，每张切计数5个高倍镜视野（400×），取平均值，为该切片阳性细胞数。

1.3 统计学分析

使用SPSSn.5统计软件处理数据。实验数据用均数士标准差（±s±s）表示。两组间样本均数的比较采用t检验，组间比较采用成组单因素方差分析。以P＜0.01为有统计学意义。

2 结果

2.1 形态学染色结果HE染色

A、B组海马神经细胞未见明显的形态学改变，C组海马神经细胞缺血性改变明显，细胞变小、有固缩，核呈三角形、条形、有固缩，核仁浓缩。D组可见部分细胞固缩，核仁浓染，但缺血性改变较轻。

2.2 原位细胞凋亡检测结果

A、B组未见阳性细胞，C组可见阳性细胞，其细胞核中有大量棕黄色颗粒。高倍镜下可见到细胞核周质靠近胞膜处有数个散在的深染的圆形颗粒状结构，即凋亡小体。C组凋亡细胞数明显高于A、B组，比较有显著差异（P＜0.01）。D组凋亡细胞数目明显低于C组，比较有显著性差异（P＜0.01）。

2.3 Bcl－2、Bax的表达结果

A组和B组可见少量Bcl－2、Bax阳性细胞，两组间比较差异无显著性（P＞0.01）。C组可见较多Bcl－2、Bax阳性细胞表达，与A组和B组相比，有显著性差异（P＜0.01）。D组Bcl－2阳性细胞表达高于C组，差异有显著性（P＜0.01）。D组Bax阳性细胞表达低于C组，差异有显著性（P＜0.01）。

3 讨论

心肺复苏后引起脑组织损伤的原因很多，但主要为心跳骤停期间组织严重缺血缺氧以及复苏后再灌注所致，再灌注损伤时，氧自由基的大量增加及细胞凋亡的激活被认为是损伤发生的重要机制，目前认为抑制复苏后发生的细胞凋亡的激活是改善复苏后脑组织功能的途径之一。EPO属于细胞因子超家族中的一员，除刺激造血外，还具有抗凋亡及细胞保护的作用［2，3］，是近年来研究较多的一个指标。EPO及EPOR广泛存在各种组织中，包括神经系统。研究表明，EPO对神经系统的发育、保护和修复具有重要作用［4］，在体内细胞培养中Hasselblatt等［5］发现EPO可抑制谷氨酸诱导的神经细胞死亡。本实验可见C组海马神经细胞细胞变小、有固缩，核呈三角形、条形、固缩，核仁浓缩，缺血性改变明显。D组可见部分细胞固缩，核仁浓染，但缺血性改变较C组轻。细胞凋亡检测结果可见D组凋亡细胞数较C组减少，说明EPO可抑制大鼠海马神经细胞凋亡，与国内外研究结果一致。

bcl－2、bax是己经明确的参与细胞凋亡调节的基因。bcl－2是重要的凋亡抑制基因，其基因产物Bcl－2与促凋亡基因bax的基因产物Bax相结合形成异源二聚体可产生抑制细胞凋亡的作用，Bax自身形成同源二聚体时可加速细胞凋亡。因此Bcl－2和Bax蛋白含量的比值决定细胞凋亡过程的发生的过程［6－8］。结合本实验A、B组大鼠海马组织可见少量Bcl－2、Bax阳性细胞，C组与 A、B组相比较Bcl－2阳性细胞数增加，表明脑缺血再灌注损伤可以产生保护性细胞因子，从而上调bcl－2的表达抑制细胞凋亡；D组Bcl－2阳性细胞显著多于C组，说明EPO能上调Bcl－2表达，减轻脑组织的凋亡。同时D组Bax阳性细胞显著少于C组，表明EPO可以下调Bax的表达，降低Bax对凋亡的促进作用，从而保护脑组织。

表1 4组大鼠脑海马神经元细胞凋亡、Bcl－2和Bax表达情况

［1］陈寿权，李章平，王姗姗等.窒息法致大鼠心脏骤停模型复苏的影响因素［J］.中华急诊医学杂志，2005，14（10）：814.

［2］Ghezzi P，Brines M.Erythropoietin as an antiapoptotic，tissueprotective Cytokine［J］.Cell Death and Differentiation，2004，11，（1）：37.

［3］王小雯.促红细胞生成素及其受体对实验性急性心肌梗死大鼠的心肌保护作用［D］.中国优秀硕士学位论文，2009.

［4］Diaz Z，Assaraf M.Astroglial cytoprotection by erythropoietin preconditioning implications for ischemic and degenerative CNS disorders［J］.Neurochem，2005，93（2）：392.

［5］Hasselblatt M，Ehrenreich H，Siren AL.The brain erythropoietin system and its potential for therapeutic exploitation in brain disease［J］.J Neurosurg Anesthesiol，2006，18（2）：132.

［6］陈 达，李莹洁，刘艳，等.促红细胞生成素对大鼠脑出血灶周组织Bcl－2、Bax的表达与神经元凋亡的实验研究［J］.中华急诊医学，2009，18（12）：1257.

［7］Halterman，M.W.，Miller，C.C.，Federoff，H.J.，1999.Hypoxiainducible factor－1alpha mediates hypoxia－induced delayed neuronal death that involves p53［J］.J Neurosci，19，6818.

［8］Piret J P，Mottet D，Raes M，et al.Is HIF－1alpha a pro－or an antiapoptotic protein［J］？Biochem Pharmacol，2006，64：889.