联合检测法对早期深部侵袭性真菌感染的临床应用研究

易震南，黎东明

（广东医学院附属医院 呼吸内科，广东 湛江 524001）

最近十几年里由于大量广谱抗生素、放化疗治疗的普遍使用以及各种免疫制剂的使用，侵袭性真菌感染的病例数量逐步上升，重点科室是呼吸科，其两大感染源是念珠菌以及曲霉，死亡率分别达到50%以及40%，因此早期确诊对于此种疾病的治疗并降低患者的死亡率有非常重要的意义［1］。临床中常用的检测方法为微生物培养以及影像学等，但都存在着不同的缺陷，如敏感性不强及耗费时间，而最近几年中运用较多的（1－3）β－D－葡聚糖试验（G 试验）则有敏感性高以及快速的优点。为更好地侵袭性真菌感染进行检测，我们将细菌培养与G实验进行联合，探讨其在临床检验中的效果。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院呼吸科自2009年1月至2010年12月收治的疑为侵袭性肺部真菌感染的患者，共96例，男性患者52例，女性患者44例，年龄皆在60岁以上，平均年龄是（72±6.2）岁。对于侵袭性肺部真菌感染的诊断标准，每位患者都至少符合其中的一项，而且所有患者的痰液培养结果均显示为阳性。

1.2 实验器材

奥林巴斯BF－260电子支气管镜；MB－80微生物动态快速检测系统；恒温仪；水浴槽；涡旋振荡器；GKT－5M Set动态真菌检测试剂盒；相应质控品（均购自北京金山川科技发展有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 拟诊为真菌感染的患者分别于入院的当天、第二天以及第三天的清晨进行深部取痰，用以痰细菌涂片以及真菌培养

1.3.2 经纤支镜对所有患者进行支气管肺泡灌洗以及活组织检查，或者进行经皮肺穿刺活检，直至患者确诊。其中支气管肺泡灌洗的方法为：（1）在要进行灌洗的肺组织处做活检孔，将一细硅胶管插入活检孔，注入浓度为2%的利多卡因，剂量为2ml，对灌洗肺组织进行局部麻醉；（2）将纤支镜的顶端楔入段或者亚段支气管开口处，连接要紧密，通过硅胶管注入灭菌的生理盐水，温度为37℃，总剂量为100 ml，每次剂量为25到50 ml，注入要迅速；（3）立即通过负压吸引对灌洗液进行回吸，压力为50到100 mm－Hg，灌洗液的回收率约为40%到60%；（4）将无菌纱布叠为双层，立即对回收液进行过滤，记录滤液量；（5）将滤液装入硅塑瓶，目的是减少细胞的黏附，将硅塑瓶置于保温瓶内，加入冰块，即刻送往实验室；

1.3.3 取患者血清以及肺泡灌洗液，进行（1－3）β－D－葡聚糖试验（G试验）；

1.4 诊断指标

确诊——具有组织学特征和（或）无污染条件下取得的标本显示为阳性；

临床诊断——具有高危因素＋临床特征＋微生物检测（或）抗真菌治疗显效；

拟诊——只有高危因素以及临床特征；

定植——不存在致病性，不需要治疗。

2 结果

2.1 患者痰培养结果

痰培结果显示患者感染细菌为两大类，念珠菌以及曲霉菌，感染例数分别为89例和7例，其中确诊病例有19例，临床诊断病例有16例，拟诊为29例，32例为定植，详见表1。

表1 侵袭性肺部真菌感染患者痰培结果

2.2 患者血清及灌洗液的G试验结果

G试验结果显示血清样本的葡聚糖浓度在4个组别中的水平与灌洗液样本的浓度有良好的一致 性，详见表2。

表2 血清与灌洗液样本的G试验结果（pg／ml）

2.3 患者血清G试验结果在4组中分布情况

G试验的诊断阈值为20 pg／ml，真菌感染组包括确认组和临床诊断组，阴性对照组为非真菌感染组，在血清诊断中，G试验的敏感性以及特异性分别为77.1%和82.8%。其中浓度高于20 pg／ml的患者有27例，详见表3。

表3 血清样本G试验结果在4组中的分布

2.4 患者支气管肺泡灌洗液样本G试验结果在4组分布情况

G试验的诊断阈值为20 pg／ml，真菌感染组包括确认组和临床诊断组，阴性对照组为非真菌感染组，在支气管肺泡灌洗液样本中，G试验的敏感性以及特异性分别为85.7%和82.8%。其中浓度高于20 pg／ml的患者有30例，详见表4。

表4 灌洗液样本G试验结果在4组中的分布

3 讨论

侵袭性真菌感染的感染菌主要为念珠菌以及曲霉，其高危患者多为恶性肿瘤患者以及免疫力低下的危重症患者［2］。大部分的真菌感染患者并不存在非常明显的临床体征，与其他类型的侵袭性疾病之间的区分比较困难。在其早期进行确诊并查明病原菌，已经成为临床工作中的重要任务。

3.1 检测侵袭性真菌感染的方法

目前检测侵袭性真菌感染的途径主要有两种，一种是培养法，它是临床上的常规检测方法，但培养法有诸多不足，如培养时间较长以及较低的特异性和敏感性；另一种是非培养法，包括血清学以及分子生物学两个方面，本文所探讨的（1－3）β－D－葡聚糖试验（G试验）就属于血清学的方法，在最近几年当中，这种方法越来越多地被用于侵袭性真菌感染的检测，其检测时间较短，而且有较高的敏感性和特异性［3］。

3.2 G试验的原理以及优缺点

（1－3）β－D－葡聚糖是一种多糖，几乎全部真菌的细胞壁当中都有这一种组分，但人体的细胞壁当中并不含有这种成分，在念珠菌以及曲霉菌引起的疾病的早期诊断可以使用 G试验［4］，2003年美国FDA已对该实验进行了批准，允许其用于检测侵袭性真菌感染，欧洲肿瘤研究治疗组织中的IFICG以及NIAID也于2008年对G试验做了定位，将其列为侵袭性真菌感染的诊断标准。国外众多研究中心已做了相关的回顾性调查，且数量巨大，证实了该实验有较好的敏感性以及特异性。

G试验是通过检测病菌的抗原来达到检测的目的［5］，但要注意几个方面的问题：抗原能够被免疫复合物清除，如果体内有这类物质，抗原的敏感性就会大大降低［6］，因此在检测之前需解离样本当中的免疫复合物；若使用多抗进行敏感性的检测，极易出现批间变异的现象，同时也会发生交叉反应，所以检测的抗原应尽量选择单抗［7］；（3）部分抗原的检测并不具有较高的灵敏性，故对这一部分抗原要改进其检测方法，提升敏感性。

在某些情况下，G检验可能会出现假阳性的结果，这种情况在国内外的研究领域也普遍存在。比如进行血液透析的患者、药物治疗中含有葡聚糖的患者，所以G试验的检测结果需要与常规检测结果紧密结合，同时配合临床的症状，对患者情况进行最终的确诊。

3.3 GM－EIA试验

另外一种通过检测抗原诊断侵袭性真菌感染的方法是半乳甘露聚糖法（GM）。曲霉菌的细胞壁上有GM，因此GM通常用于检测曲霉菌，在曲霉菌的菌丝生长时，GM即被释放，进入周围组织。有相关研究报道指出，半乳甘露聚糖－酶联免疫分析（GMEIA）可用于检测侵袭性曲霉病，尤其是对于患有恶性血液病的患者，但是，对于进行器官移植的接受者，这种检测作用并不明显；若患者的侵袭性曲霉病疑似性较高，则GM－EIA则会显示出良好的敏感性以及特异性，甚至有很高的阳性预测值以及阴性预测值；若被诊断为高疑侵袭性曲霉病患者在，则其GM的抗原水平会显著降低，且预后效果较好；若GM不降反升或维持不变，则表示疗效不良。治疗效果可以通过血清中GM的水平反映出来，对患者进行抗真菌治疗，可以大幅减少血清中抗原数量，GM－EIA的敏感性也随之下降。

3.4 检测侵袭性真菌感染的分子学方法

3.4.1 DNA序列比对 这种方法的原理是，两个序列进行彼此之间的相似区域的对比，同时辅以对比保守型位点，探寻它们之间的进化关系。对于生长缓慢的病原真菌可以用这种方法进行鉴定，但病原真菌在临床当中发现的种类在持续增长，故此种方法更适用于对新发现的真菌进行鉴定，且有着很高的特异性。DNA序列方法的不足在于检测时间较长，至少需48小时，而其敏感性也受众多因素的影响，如标本的类型以及其DNA的提取方法，而且若因环境当中存在真菌，这种方法是无法对其排除的。

3.4.2 PCR产物电泳 这种方法的原理是，内部转录间隔区的各种片段具有不同的长度以及种属，利用这种特异性，在DNA进行扩增时，对其产物进行电泳［8］。但这种方法有比较大的局限性，若不同种类的微生物所具有的片段是大小相同的时候，这种鉴定的结果可能就会不准确。对毛细管电泳的扩增产物进行分析时，使用的是荧光分析器，其灵敏度非常高，精确到1个碱基，同时也有这相当高的工作效率，半小时内检测的样本可大96个。但若病原真菌有较高的变异性，则不适合使用这种方法。

综上所述，血清学的特点是比较简便而且快速，在真菌感染方面，最有前途的诊断措施是抗原检测，且已有相当数量的试剂盒面市，但是还需对各种方法进行广泛的研究和检测，证实其敏感性以及特异性。

从本次的研究可以看出，常规的培养方法与G试验检测的结果有着比较高的一致性，能够对患者进行更迅速、更精确的诊断。侵袭性真菌感染的诊断途径较多，但技术方面不够纯熟，使用联合检测的方法对其进行诊断具有十分重要的意义。

目前，针对侵袭性真菌感染的检测技术依旧有限，比较理想的途径应更快速、操作简单，同时具备高度的敏感性以及特异性，临床对侵袭性真菌感染的检测必须联合多种技术，最终达到确诊的目的。

［1］李若瑜.多学科携手应对侵袭性真菌感染的挑战［J］.中华医学杂志，2010，90（6）：361.

［2］吕沛华，赵蓓蕾.（1，3）β—D一葡聚糖检测诊断侵袭性真菌感染的临床价值［J］.中华结核和呼吸杂志，2009，30（5）：31.

［3］李世荣，王 红，文 艳.血浆（1，3）一β一D葡聚糖与抗深部白色念珠菌感染药物疗效关系的实验研究［J］.临床和实验医学杂志，2009，7（9）：20.

［4］PazosC，Pont6n J，Del PalacioA.Contributionof（1－＞3）pD－glu—can chromogenic assay to diagnosis and therapeutic monitoring of invasive aspergilosis in neutropenic adult patients：a comparison with serial screening for circulating galactomannan［J］.J Clin Mi·embiol，2005.43：299.

［5］俞万钧，傅中明.血清半乳甘露聚糖对侵袭性真菌感染的早期诊断价值（2010）［J］.现代实用医学杂志，2010，26（2）：489.

［6］Del Palacio A，Cuetara MS.Pontom Laboratory diagnosis of invasive aspergillosis［J］.Iberoam Micol，2009，16（6）：90.

［7］李若瑜，高露娟.血清半乳甘露聚糖和血浆（1，3）β－D一葡聚糖检测诊断侵袭性真菌感染［J］.中华医学杂志，2010，40（7）：371.

［8］Obayashi T，Yoshida M ，Mori T，et al.Plasma—beta—Dglucan measurement in diagnosis of invasive deep mycosis and fungal febrile episodes［J］.Lancet，2009，356（8941）：17.