10%中性缓冲福尔马林配制中应注意的问题

陈余朋，王行富，王 密，王鹏程

福建医科大学附属第一医院病理科(福建 福州 350005)

10%中性缓冲福尔马林溶液(pH值7.2～7.4)是临床诊断及实验病理学中最常用的固定剂，具有较强的组织穿透能力，组织收缩小，固定均匀、稳定，能使组织硬化，保证HE制片的高质量；能更好的保持组织的抗原性[1,2]，有利于免疫组织化学标记物的检测。研究[3]表明用10%中性缓冲性福尔马林固定剂的石蜡组织提取的DNA在质量上明显优于普通的非缓冲型福尔马林固定剂。ASCO /CAP HER-2检测指南和我国2009年HER2基因检测指南指出，组织处理的标准化固定剂为10%中性缓冲福尔马林, 以获得最佳的原位免疫荧光检测[4,5]。目前很多医院尤其基层单位在10%中性缓冲福尔马林配制上并不规范，主要有以下问题应引起同行重视。

试剂称重的准确性按照临床病理技术操作规范[1]，10%中性福尔马林固定液的配制方法(1000 ml)：甲醛(40%)100 ml，无水磷酸氢二钠6.5 g，磷酸二氢钠4 g，蒸馏水900 ml。该配制方法并不能直接准确地配制10%的中性缓冲福尔马林，因为其中磷酸二氢钠并没注明是无水还是含一水化合物(NaH2PO4·H2O)或二水化合物(NaH2PO4·2H2O)，使用不同磷酸二氢钠的量将直接影响最终的pH值。按照《组织学技术的理论与实践》介绍的10%中性福尔马林的配制方法[2]:福尔马林(37%-40%的甲醛溶液) 100 ml，Na2HPO46·5 g，NaH2PO4·H2O 4 g，蒸馏水900 ml,pH值应为7.2-7.4, 该配方明确磷酸二氢钠是一水化合物，只要这样准确称量，准确配制，pH值即为7.2～7.4。用于配制10%中性缓冲福尔马林的最常用的Na2HPO4有两种形式即无水Na2HPO4和Na2HPO4·12H2O；最常用NaH2PO4也有两种形式即NaH2PO4·H2O和NaH2PO4·2H2O。在选择试剂的时候应该注意所购买的试剂Na2HPO4和NaH2PO4是否含有或含有几个水分子化合物，应根据M=m/n进行换算，准确称量，严格配制并监测缓冲液的pH值，避免发生不必要的错误。当选择Na2HPO4·12H2O和NaH2PO4·2H2O时，根据M=m/n，换算Na2HPO4·12H2O和NaH2PO4·2H2O量分别为16.38 g和4.52 g，准确称量，准确配制，pH值应为7.2～7.4。

试剂的保存Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·H2O、NaH2PO4·2H2O等，其水化含量在自然状态下并非一成不变，如果试剂密封不好，可能在干燥空气中风化，失去结晶水，例如Na2HPO4·12H2O在空气中风化后，极易失去五分子结晶水而形成七水化合物Na2HPO4·7H2O，分子量发生变化，影响试剂的准确称量。无水磷酸氢二钠略有吸湿性，在湿空气中易水化结块。因此试剂要求密封保存。

pH值检测准确测pH值一般选用pH计进行，pH计可以精确到0.1～0.01。pH试纸只能精确到1～0.1。造成这种差异的原因是，pH计测量pH是靠感应器感应、渗透压或别的参数测量，因此科学精确；pH试纸靠特殊颜色反应，不仅人眼对色觉的鉴定会造成误差，另外，比色卡的印刷也会造成一定误差，都会导致判读不够精准。在质控检查的时候，经常发现用pH值试纸检测的10%中性缓冲福尔马林实际偏酸性。

质量控制对所配制的10%中性缓冲福尔马林，要制定严格的质量控制制度，定期测量pH值。中性缓冲福尔马林的试剂要彻底溶解，并且搅拌均匀，配好的中性缓冲福尔马林溶液要用密闭的塑料桶存放，以防福尔马林挥发。日常配制中性混合磷酸盐缓冲液时，其pH值往往因化学试剂质量、技术质量等因素稍有误差，可酌加少量1M Na2HPO4或1M NaH2PO4溶液校正后使用[6]。

试剂质量 建议购买分析纯(AR)试剂，分析纯主成分含量很高、纯度较高，干扰杂质很低，适用于工业分析及化学实验。试剂要符合国家标准，选择外包装完好无损，试剂瓶口密封，生产日期越新越好，在有效日期范围内，选择质量可靠的厂家。当选择有破损、不够密封、过期的含水化合物试剂，可能会出现含水化合物试剂在空气中风化，失去结晶水；有吸湿性的试剂在湿空气中易水化结块，从而影响试剂的质量和配制称量的准确性。

配制人员职业责任感目前基层病理工作存在一些问题，病理工作单调，不受重视，导致少数人员工作积极性不高，责任感不强等，从而影响试剂的配制质量。每个科室或研究单位应该形成质量检测和质量控制制度，由专人配制，专人管理，对每批次的试剂配制做好记录，并实行每天监测pH值。质控小组随机抽查，对于不合格的试剂误差不大时，进行必要调整，明显误差者直接按照废液处理，确保配制试剂的质量。

10%中性缓冲福尔马林配制的好坏直接影响组织的固定，组织固定的好坏直接影响制片质量、HE染色效果、特殊染色、免疫组化染色以及分子生物学方面的检测。因此正确配制10%中性缓冲福尔马林至关重要，同时作为一个合格的病理技术人员，除了要有过硬的专业技术，还要有高度的职业责任感，认真对待、科学处理组织固定的每一步骤，为病理诊断、免疫组化及分子生物学的检测打好坚实的基础。

[1] 中华医学会编著.临床技术操作规范 病理学分册[M].北京：人民军医出版社，2004：28.

[2] John D.Bancroft,Mariln Ganmble主编，周小鸽，刘勇主译.组织学技术的理论和实践[M].北京：北京大学医学出版社，2010：45-57.

[3] Zsikla M，Baumann G.Effect of buffered formalin on amplification of DNA from paraffin wax embedded small biopsies using real-time PCR[J].Journal of clinical pathlogy,2004,57:654-656.

[4] Wolff AC,Hammond ME,Schwartz JN,et al.American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendation for human epidermal growth factor 2 testing in breast cancer[J].Arch pathol Lab Med,2007,131(1):18-43.

[5] 《乳腺癌HER-2检测指南》编写组.乳腺癌HER-2检测指南(2009版)[J].中华病理学杂志，2009，38(12)：836-840.

[6] 赵宝忠，孙智才，刘增辉，等.对福尔马林固定剂相关理论的再认识[J].临床与实验病理学杂志，2007，25(3)：337-338.