假单胞菌B41产果胶酶发酵条件的研究

廖 敏，陈希文，姜立春，阮期平*

（绵阳师范学院 分子生物学与生物制药重点实验室，四川 绵阳 621000）

竹原纤维是一种全新概念的凉爽、舒适性纤维。竹原纤维细而中空，横截面布满椭圆形孔隙，可以在瞬间吸收并蒸发水分，有很高的吸汗能力和较好的透气性[1]。我国是世界上竹的种植大国，为制作竹原纤维提供充足的原料。

现有的竹原纤维制取工艺如机械加工、机械化学联合加工和化学加工3种方法都不能符合对竹原纤维开发的要求，真正绿色的竹原纤维的开发需要寻求新的方法[2]。竹纤维的单纤维长度很短，长宽比远低于大麻、亚麻纤维，因此如果对竹纤维进行脱胶处理，脱胶工艺也应采用与黄麻纤维相类似的轻度脱胶方式，去除部分胶质以改善纤维可纺性，并保留部分胶质，利用残胶将极短的单纤维粘连起来，保证一定的纤维长度，满足纺纱工艺要求。生物技术脱胶的关键技术之一是分离到高产果胶酶菌株，用于竹原纤维制作过程中脱胶工序[3]。

本实验室从北川传统沤竹池入手，通过初筛、复筛等手段，筛选出竹原纤维脱胶菌株——假单胞菌B41（Pseudomonas.sp）。该菌生长速度快，产酶发酵周期短，具有工业推广的价值。本文以假单胞菌B41为出发菌株，对其发酵条件的优化进行了初步研究，为其深入研究和应用奠定基础，将解决工业生产中利用生物技术制作竹原纤维的部分问题。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种：假单胞菌B41（Pseudomonas.sp），4℃冰箱保藏，由绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室分离纯化获得。

1.2 培养基

斜面培养基：蛋白胨5.0g/L，牛肉膏3.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂20.0g/L，pH值为7.0，0.1MPa、121℃灭菌20min。

基础发酵培养基：果胶20.0g/L，蛋白胨10.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，pH值为7.0，0.1MPa、121℃灭菌20min。

1.3 试验方法

种子培养：斜面活化后接种，摇床转速150r/min、30℃培养24h。

摇瓶发酵培养：250mL锥形瓶装液量30mL，接种量5%，摇床转速180r/min、30℃培养24h。

粗酶液制备：将摇瓶发酵结束的发酵液于4℃、5000r/min离心15min，取上清液作为果胶酶活力待测粗酶液。

酶活测定方法[4]：采用DNS分光光度计法，取1%果胶溶液（磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液配制，pH值为5.0）1mL，加入1mL适当稀释的发酵粗酶液，40℃水浴反应30min，然后加人2.0mL DNS试剂，沸水浴加热5min，冷却后定容至25mL。取经加热煮沸5min的失活酶液代替粗酶液作空白。波长540nm处测吸光度值。酶活力单位定义：果胶酶降解果胶底物每分钟催化果胶水解生成1μg半乳糖醛酸所需酶量为1个酶活力单位。

2 结果与讨论

2.1 碳源种类及浓度的对产酶的影响

因为果胶酶属于诱导酶，需要在果胶物质存在的碳源条件下才能产生[5]。所以选取含果胶的天然物质（如桔皮粉、麸皮、玉米粉、稻草杆）为碳源[6]，以20.0g/L的量等量代替基础发酵培养基中的果胶制成培养基，摇床发酵，测定酶活力，结果见图1。试验结果表明，以桔皮粉为碳源效果最好。进一步研究桔皮粉添加量对产酶的影响，结果（图2）表明，当桔皮粉添加量为15g/L时酶活力最高。

2.2 氮源种类及浓度的影响

在碳源优化的基础上，采用同样的方法考察不同氮源对产酶的影响，结果见图3。试验结果表明，蛋白胨作为氮源时酶活明显比其他氮源高。进一步研究蛋白胨添加量对产酶的影响，结果（图4）表明，当添加量为12.5g/L时酶活最高。

图2 桔皮粉添加量对产酶的影响Fig.2 Effect of additional amount of citrus peel powder on pectinase production from B41

图3 氮源种类对产酶的影响Fig.3 Effect of nitrogen sources on pectinase production from B41

图4 蛋白胨添加量对产酶影响Fig.4 Effect of addition of peptone on pectinase production from B41

2.3 金属离子的影响

无机盐的重要功能是构成细胞组成部分并维持酶的活性，调节细胞渗透压、氢离子浓度、氧化还原电位等[7]。而微量的无机盐往往与酶活性有关，或参与酶的组成，或是许多酶的调节因子[8]。在以上碳源氮源优化的基础上，向发酵培养基中加入不同种类的无机盐，测定果胶酶酶活力，结果见图5。试验结果表明，金属离子Fe2+能提高酶的活力，而Mg2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+对菌种产果胶酶活力有不同程度的抑制作用。进一步研究Fe2+对产酶的影响，结果（图6）表明，当添加量为0.5g/L时酶活最高。

2.4 初始pH值对产酶的影响

基于上述优化条件，调节发酵培养基的初始pH值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0接种后培养36h测定不同pH值时的酶活力，结果见图7。当初始pH值为6.0时，发酵液酶活力最大，高于8.0之后，酶活力显著下降。

图5 金属离子种类对产酶的影响Fig.5 Effect of types metal ions on pectinase production from B41

图6 Fe2+添加量对产酶的影响Fig.6 Effect of addition of Fe2+on pectinase production from B41

图7 初始pH值对产酶的影响Fig.7 Effect of initial pH value on pectinase production from B41

2.5 最佳产酶培养基配方正交试验

在单因素实验基础上，选取桔皮粉、蛋白胨、FeSO4、初始pH值4因素做L9（34）正交试验，结果见表2。方差分析见表3。

表1 优化产酶培养基试验正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test for optimized fermentation medium

表2 优化产酶培养基正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test for optimized fermentation medium

表3 优化产酶培养基正交试验方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment result of medium optimization

由表2可以看出，各因素的显著性关系为A>D>C>B，得出最优试验方案为A3B1C3D2。由于正交试验的最优方案A3B1C3D2就是正交试验表中第7号试验。因此当发酵培养基为A3B1C3D2，即桔皮粉20.0g/L，蛋白胨10.0g/L，FeSO40.5g/L，初始pH值为5.5，果胶酶酶活可达710U/mL。

2.6 装液量的影响

图8 装液量对产酶的影响Fig.8 Effect of liquid filling rate on pectinase production from B41

在2.5确定的最佳发酵培养基的条件下，选取250mL三角瓶摇床培养，观察不同装液量对产果胶酶的影响[9]，结果见图8，装液量为50mL时，酶活力最大，随着装液量的升高，酶活力逐渐下降。说明菌株B41是好氧菌，在生长代谢过程中，对氧的需求较高。

2.7 接种量的影响

将培养24h的液体菌种接种到最佳发酵培养基中，考察接种量对产果胶酶的影响。结果（图9）可知，当接种量为3%时，果胶酶活力最高。

图9 接种量对产酶的影响Fig.9 Effect of inoculum on pectinase production from B41

2.8 发酵温度的影响

取250mL三角瓶，装液体最佳发酵培养基50mL，按3%接种量，在不同温度下摇床培养，观察发酵温度对B41产果胶酶的影响，结果见图10。结果表明，B41产果胶酶活力随发酵温度的升高而提高，但超过30℃，果胶酶活力逐渐降低，初步确定最佳产酶发酵温度为30℃。

图10 发酵温度对产酶的影响Fig.10 Effect of fermentation temperatures on pectinase production from B41

2.9 发酵时间的影响

在上述培养条件下，选取不同的发酵时间，测定果胶酶活力，观察发酵时间对B41产酶的影响，结果见图11。由图11看出，发酵时间在28h时，酶活力趋于最高，32h时达到最高，此后相对维持在一个水平线。当发酵时间超过40h，酶活力下降的趋势十分明显。

2.10 最佳产酶条件正交试验

在单因素试验基础上，选取装液量、接种量、发酵温度、发酵时间4因素做正交试验[10]，结果见表5，方差分析见表6。

图11 发酵时间对产酶的影响Fig.11 Effect of fermentation time on pectinase production from B41

表4 优化产酶条件试验正交试验因素水平Table 4 Factors and levels of orthogonal test for enzyme production condition optimization

表5 产酶条件优化正交试验结果与分析Table 5 Results and analysis of orthogonal test for enzyme production condition optimization

由表5可以看出，各因素的显著性关系为A>B>D>C，得出最优组合为A2B1C2D2。由于正交试验的最佳方案是A2B1C2D3即正交试验表中第4号试验，为进一步验证正交试验推论结果，又进行了最优组合与最佳方案的对比试验，结果见表7。从表7得知，预测的最优组合与最佳试验方案相比，最优组合条件下所产果胶酶酶活力更高。因此当发酵培养条件为A2B1C2D2，即装液量50mL，接种量2%，发酵温度30℃，发酵时间32h，果胶酶酶活可达739U/mL。

表6 优化产酶条件正交试验方差分析Table 6 Variance analysis of variance of orthogonal experiment result of enzymes production

表7 正交试验验证Table 7 Verification of orthogonal experiment result

3 结论

经单因素和正交试验分析，得到最优的假单胞菌B41液态摇瓶培养产果胶酶的发酵培养基为桔皮粉20g/L，蛋白胨10g/L，FeSO40.5g/L，初始pH值5.5。最佳发酵条件为装液量50mL，接种量2%，发酵温度30℃，发酵时间32h。在此优化条件下，果胶酶活力为739U/mL。

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