大骨节病患者与健康人软骨细胞转化生长因子-β mRN A的表达差异

李若飞,高大龙,涂忠民,杨雷刚,董舒,任军龙,解俊杰,赵昕

(陕西省咸阳市中心医院骨一科,陕西 咸阳 712000)

大骨节病(kaschin-bick disease,KBD)是一种病因不明的地方性慢性骨关节病,起病隐匿。中国国内又叫矮人病、算盘珠病等,国际医学界称本病为 Kaschin-Beck病。大骨节病在国外主要分布于西伯利亚东部和朝鲜北部,在中国分布范围大,从东北到西南的广大地区均有报道,主要发生于黑、吉、辽、陕、晋等省,多分布于山区和半山区,平原少见。本病在各个年龄组都有发生,但多发于儿童和青少年,成人很少发病,无明显的性别差异。本病常常多发性、对称性侵犯软骨内成骨型骨骼,导致软骨内成骨障碍、管状骨变短和继发的变形性关节病。临床表现为关节疼痛、增粗变形,肌肉萎缩,运动障碍[1,2]。其主要特征是青少年发育过程中软骨内化骨型的透明软骨发生多发性灶状软骨坏死,并导致软骨内化骨障碍和继发性骨关节病。病理学研究发现,大骨节病属于软骨营养不良性变化,包括软骨萎缩、变性和坏死的病理过程,同时出现修复性适应性变化,导致软骨内骨化型的透明软骨(骺软骨、骺板软骨和关节软骨)发生多发性灶状坏死及继发性骨关节病。

转化生长因 子 -β(transform growth factor β ,TGF-β )是一大类调节细胞生长分化的因子,在许多器官或组织的生长和分化中起着重要的作用[3-5]。现已证实,TGF-β在软骨发育过程中有提高硫酸化蛋白多糖、胶原、软骨连接蛋白及碱性磷酸酶活性的作用。在软骨细胞分化早期,促进未分化的间充质细胞形成软骨[6],但抑制终末细胞的肥大、分化及基质矿化。其作用可以通过作用于细胞核的途径来进行[7]。有学者提出 TGF-β受体对 TGF-β反应性的丧失可促进小鼠软骨细胞的终末分化并导致类似于人类骨关节病的发展[8]。大骨节病晚期也有明显的骨关节病改变,而大骨节病软骨 TGF-β基因水平表达方面的研究未见报道。因此,本实验对这方面进行了初步的探索,以进一步阐明大骨节病的发病机理。

1 材料与试剂

1.1 时间地点 本实验在 2009年 12月至 2011年2月在西安交通大学医学院生物医学研究实验中心完成。

1.2 对象 大骨节病和正常对照关节软骨标本各 5例。大骨节病关节软骨取自咸阳市第二人民医院对大骨节病患者实施膝关节清理术后的关节软骨,其中男 3例 ,女 2例,年龄39～57岁。正常组软骨标本取自于咸阳市中心医院因车祸等意外原因所致关节骨折手术所取软骨,其中男3例,女2例,年龄28～54岁。纳入标准:a)大骨节病标本符合国内大骨节病临床诊断标准(GB16003-1995)诊断。b)两组标本软骨均取自膝关节。 c)根据国务院《医疗机构管理条例》规定 ,患者或家属对标本收集及用途均知情同意。排除标准:遗传性、退行性骨关节炎和类风湿性关节炎。

1.3 主要试剂 DNA marker购自 Takara公司;DN A凝胶回收试剂盒购自 Omega公司;细胞总 RN A提取试剂盒、cDN A合成试剂盒购自M BI公司;引物合成及基因测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成;其他生物化学试剂和耗材购自西安润德生物工程公司。

2 方法与步骤

2.1 提取软骨细胞总 RNA 选择 5位 KBD患者和5位健康人的软骨组织,按照 FAST200总 RNA提取试剂盒操作,得到5种总RNA,分别命名为 RN A-K1/2/3/4/5和 RN A-N1/2/3/4/5。总 RNA提取步骤(以 1个样本为例):a)样品预处理:将软骨研碎,胰酶消化细胞后,留下细胞团块和适量上清(2×106细胞/100μL),充分震荡致细胞团块松散,放入新的无菌无酶的eppendorf管中。b)处理好的样品中加入RA2液500 μL,充分颠倒 1 min。 c)将样品裂解物倒入或吸入内套管,4℃、12000 rpm离心1 min。d)弃外套管内液体,内套管中加入 500μL洗液,4℃、12000rpm离心 1min。e)重复上步骤条件洗涤一次。f)弃外套管内液体,内套管中不加入洗液,4℃、12000 rpm离心 1 min。g)将内套管放入新的无菌无酶的eppendorf管 ,在膜中央加入 25μL洗脱液。室温静置1min,离心 1min,得到 25μL总 RN A。

2.2 逆转录合成cDNA 分别以10份软骨细胞所提取的总RN A为模板,用 MBI逆转录试剂盒进行逆转录反应,得到10种 cDNA产物,命名为 RT-K1/2/3/4/5和 RT-N1/2/3/4/5。逆转录反应操作步骤 (以1个样本为例):a)0.2mL无菌无酶的 PCR反应管中依次加入 5μL总 RNA、1 μL Random hexamer primer和6μL Depc-H2O,共12μL体系。混匀离心,70℃反 应 5min。 b)加 入 4 μL5× reaction buffer、 2μL dNTPmix和1μL Ribolock,共 19μL体系。混匀离心,25℃反应 5 min。c)加入 1μL M-Mμlv。混匀离心,25℃反应 10 min,42℃反应 60min,70℃反应 10min,得到 20μLcDNA产物。

2.3 引物设计与合成 根据 Genebank查询得到人 TGF-β的基因序列,其 Gene ID为NM-000660。设计针对 TGF-B基因的特异引物 ,扩增基因片段位于 TGF基因的981～1230,大小为250bp。同时设计 1对针对人β-actin的引物,作为内参,扩增基因片段大小为146 bp。将设计好的引物序列交由上海生工生物公司合成。TGF-β引物序列如下。上游 TGF-P1:5′-CAAGACT ATCGACATGGAGC-3′; 下 游 TGF-P2:5′-GGTT TCCACCATT ACACGC-3′。β-actin引物序列如下。上游 actin-P1:5′-CTATCGGCAATGAGCGGT TCC-3′;下 游actin-P2:5′-TGTGT TGGCATAGAGGTCTTT ACG-3′

2.4 Pcr扩增TGF-β基因 选择西安润德生物公司生产的2× PCR Mix反应体系。以10份软骨细胞所提取的总 RN A逆转录得到的 cDNA为模板,利用特异引物 actin-P1/P2和TGF-P1/P2扩增目的基因,得到 10种actin和10种 TGF-β的PCR产物。分别命名为 PCR actin-K1/2/3/4/5、PCR TGFK1/2/3/4/5、PCR actin-N1/2/3/4/5和 PCR TGF-N1/2/3/4/5。

反应体系为(50μL):PCR Mix25μL,上下游引物 P1、P2各 1μL,cDNA 2μL,ddH2O 21μL。 反应条件:预热 94℃5 min,循环 94℃ 30 sec、55℃ 30 sec、 72℃ 30 sec(35 cycles),后延伸 72℃ 3min。

2.5 琼脂糖凝胶电泳以及图像分析 取20种RT-PCR产物各5μL,分别加入2%琼脂糖凝胶的加样孔内,以100 bp DNA marker作为参照。直流电 100V电泳 30 min。在紫外灯下观测电泳条带位置并照像。利用图像处理软件分析各条带灰度。

2.6 统计学处理 应用统计学软件 SPSS 13.0进行数据分析,采用t检验进行统计学检验,设定P＜0.05认为差异有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 RT-PCR电泳图像 见图1～2。

3.2 图像分析测定mRN A表达差异 利用图像处理软件分析 RT-PCR各条带灰度,以β-actin为参照,计算相对灰度值,如图3所示,可见大骨节病患者软骨细胞的 TGF-β表达低于健康成人。

大骨节病患者 TGF-β RT-PCR相对灰度值为 0.8262±0.0361,健康成人为1.3628±0.1011,用 SPSS 13.0进行统计学分析,采用t检验分析t=11.1732,差异具有统计学意义(P ＜0.05)。

图1 大骨节病患者软骨细胞 RT-PCR电泳图像

图2 健康人软骨细胞 RT-PCR电泳图像

图3 不同个体软骨细胞 TGF-β表达的变化

4 讨 论

大骨节病是一种原因不明的地方性骨关节性疾病。在我国、前苏联、日本、朝鲜等国均有该病的报道。 KBD的病因说之一即是生物地球化学说[9,10],它指的是外环境水、土、粮低硒,但是环境低硒不是其特异性致病因子,多项研究表明是多种细胞因子的共同作用。以往研究表明,炎症细胞因子在骨关节病的发病中具有重要的作用。如白细胞介素-1可诱发关节炎症和关节翳的形成,也可通过 RAN K/RAN KL破坏骨和软骨。肿瘤坏死因子通过上调血管内皮细胞黏附因子-1的表达,可诱导核因子κ B活化。关节滑膜中的肿瘤坏死因子可活化内皮细胞,刺激纤维母细胞分化,并可诱导金属蛋白酶以及白细胞介素-1、白细胞介素-6等的产生,以及通过白细胞介素-1间接引起组织的损伤[11-14]。白细胞介素-1、TNF在软骨损伤过程中,可激活基质降解酶,促进软骨基质分解,刺激关节局部炎性、免疫反应。

转化生长因子(transforming growth factor,TGF)家族包括结构相似而功能不同的五个多肽成员,有激动剂、抑制剂和苗勒管抑制物质等。大多数的哺乳动物细胞都具有分泌TGF的功能。在体内,大多数的细胞都可表达 TGF受体(TGF-R)[15]。 TGF-β是 TGF家族成员之一,是一种二聚体多肽,具有多种生物功能。研究表明,TGF广泛参与体内各种病理生理过程,对细胞的增殖与分化、细胞外基质的产生、创伤愈合、胚胎发育、血管生成、纤维化、细胞凋亡及机体免疫系统均有着重要作用[16]。

转化生长因子β(tromsforming growth factor-β,TGF-β)是一种多肽、广泛存在于正常组织中,尤其以骨组织中含量最为丰富,TGF-β在调节骨代谢、骨改建过程中发挥重要作用,它调节多种细胞如成骨细胞、破骨细胞的增殖和分化,并影响骨基质合成[17]。大骨节病患者发病多始于儿童期,在成人表现明显。其发病与骨关节炎有相似之处。在骨细胞的分化生长中,需要转化生长因子的调节。而大骨节病的骨细胞分化显然是存在障碍的。这与转化生长因子的缺乏存在一定的关系。 TGF-β在体内没有明显骨诱导作用,但体外实验表明 TGF-β能够刺激体外培养的骨祖细胞增殖,能够促进骨髓基质细胞的成骨分化[18]。在成骨细胞上分布着高亲和力的TGF-β 受体,受 TGF-β的刺激后,可合成大量基质。 TGF-β最初刺激成纤维细胞和成骨细胞的有丝分裂,使其增殖分化为成骨细胞,增加骨钙含量。

从大骨节病的表现看,其主要累及关节软骨、骨骺端的生长发育,病理表现为透明软骨变性坏死。既往的研究表明,软骨细胞和骨细胞的成熟分化过程中,需要包括转化生长因子在内的众多细胞因子的参与和调节。TGF-β能够促进骨及软骨分化、改建等过程。大骨节病患者软骨细胞中细胞因子的缺乏,与其发病存在一定的联系。在基因水平,TGF-β的表达在健康人和大骨节病患者中的差异,需要用实验去验证。

本实验从 mRNA水平验证了 TGF-β在大骨节病患者和健康人软骨中的表达是不同的。大骨节病患者软骨中TGF-β的表达低于健康人群。在正常软骨发生过程中,TGF-β1,TGF-β 2,TGF-β 3在软骨细胞的表层,过渡层及成熟度很低的细胞层中表达强烈。大骨节病病理改变主要表现为深层软骨细胞的坏死,这提示随着坏死细胞的增多,TGF-β的表达减弱。有文献报道,TGF-β可通过增强软骨细胞的增殖,诱导软骨细胞合成的活性等一系列作用参与软骨修复过程。这一结论的得出,为我们下一步研究大骨节病的发病机制,进而为治疗大骨节病奠定了基础。

本研究的缺点之一在于病例数偏少,难以覆盖大样本人群,在以后的研究中,将尽可能扩大样本量,以减少偏倚;另一缺点在于未能从蛋白水平加以验证,这将是下一步研究的目标和重点工作。

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