刺五加多糖对断奶仔猪生长性能和免疫指标的影响

韩 杰边连全刘显军张 飞杨侃侃

(1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，沈阳 110866;2.洛阳师范学院生命科学系，洛阳 471022;3.沈阳农业大学科研种猪场，沈阳 110866)

仔猪的免疫保护主要来自2个方面，一是从母乳中获得的被动免疫保护，二是自然状态下仔猪自身免疫系统发育形成的主动免疫保护。3～4周龄的仔猪由于自身免疫系统尚未发育完善，体液免疫产生的抗体水平和细胞免疫功能还很低，此时若实施断奶，仔猪易发生免疫应激，出现生长停滞、饲料效率降低、腹泻等现象［1－3］。此外，免疫应激还是导致“仔猪早期断奶综合征”的重要因素之一。因此，采取一定的营养措施增强断奶仔猪的免疫功能，对缓解断奶应激所致的生长抑制具有重要意义。

刺五加多糖(Acanthopanax senticosus polysaccharide，ASPS)是从刺五加根中分离出的水溶性多糖，具有良好的抗肿瘤、调节免疫、微生态调节、抗感染等功效［4－7］。近年来，ASPS在药理研究和临床应用上备受关注，但在畜禽生产中的研究和应用却鲜见报道。本试验以早期断奶仔猪为试验动物，旨在研究ASPS对断奶仔猪生长及免疫指标的影响，并探讨其在仔猪饲粮中的最佳添加水平，为ASPS作为免疫调控剂在仔猪饲粮中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及饲粮

选取(28±3)日龄、平均体重为(7.13±0.67)kg的“长白×约克夏”二元杂交断奶仔猪，采用半开放猪舍，地面饲养，自然通风，自由采食和饮水，免疫和驱虫程序按猪场常规同步进行。基础饲粮是参照NRC(1998)仔猪营养需要配制的粉状配合饲料，基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.2 试验设计

将96头断奶仔猪随机分为6组，每组4个重复，每个重复4头猪，试验期21 d。对照组饲喂不添加抗生素的基础饲粮，试验组饲喂在基础饲粮中分别添加 150、300、500、800 和 1 000 mg/kg ASPS的试验饲粮。

1.3 试验材料

ASPS：以刺五加根为原料，采用热水浸提乙醇分级沉淀工艺提取，苯酚－硫酸法测得多糖纯度为 82.5%。

主要仪器：LRHS－150B型恒温恒湿培养箱(北京莱凯博仪器设备有限公司)、BioTek-Synergy2多功能酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)、Uritest－3000型全自动血细胞分析仪(优利特集团有限公司)、过滤除菌装置和滤膜、96孔聚丙乙烯酶联反应板96孔细胞培养板(平底)。

主要试剂：稀释液［0.05 mol/L pH 9.6 碳酸盐缓冲液、0.01 mol/L pH 7.2 磷酸盐缓冲液(PBS)］、洗涤液(PBS中加 0.05%吐温 －20)、封闭液(PBS中加10%胎牛血清)、邻苯二胺(OPD，美国Sigma公司)、辣根过氧化物酶标记兔抗猪免疫球蛋白G(HRP－兔抗猪IgG)、台盼蓝(美国Sigma公司)、四甲基偶氮唑盐(MTT)、刀豆球蛋白A(ConA，美国Sigma公司)、RPMI-1640完全培养液(美国HyClone公司)、淋巴细胞分离液。

1.4 试验过程及样品制备

试验于开始和结束时，清晨称量空腹仔猪的个体重，记录始重(initial body weight，IBW)和末重(final body weight，FBW)，计算每头仔猪的平均日增重(average daily gain，ADG);准确记录各重复中仔猪的投料量和余料量，计算每头仔猪的平均日采食量(average daily feed intake，ADFI);根据ADG和ADFI计算料重比(feed/gain，F/G);每日观察仔猪的腹泻情况，记录每天的腹泻头次，计算腹泻率(diarrhea rate，DR)。

试验第14天，每个重复随机取1头仔猪，肌肉注射1 mg/kg体重鸡卵清白蛋白(ovalbumin，OVA，美国Sigma公司，纯度＞90%)。试验第21天，取每个重复中第14天注射过OVA的仔猪，用真空采血管前腔静脉采集血液2份，1份用不带有肝素的普通真空采血管采血5 mL，3 500 r/min离心5 min，分离血清，－20℃冰箱冻存，用于测定血清特异OVA抗体和皮质醇水平;1份用肝素抗凝管采血5 mL，于4℃冰箱保存，用于外周血淋巴细胞转化率(lymphocyte proliferation，LP)的测定。

1.5 检测指标及测定方法

1.5.1 生长性能

1.5.2 腹泻率

1.5.3 外周血淋巴细胞转化率

外周血淋巴细胞转化率测定采用四甲基偶氮唑盐(MTT)微量酶反应比色法(简称MTT法)，在10 mL离心管中加入4 mL淋巴细胞分离液，然后沿管壁缓慢加入3 mL肝素抗凝血，2 500 r/min离心20 min，取中间白细胞层约1 mL，加入3～5倍体积的RPMI-1640完全培养液洗涤3次，每次2 000 r/min离心10 min，弃上清。然后将细胞悬浮于RPMI-1640完全培养液中，用台盼蓝染色，计数活细胞(＞95%)，调整细胞浓度为2×106个/mL。

向细胞悬液中加入ConA(终浓度为5 μg/mL)，另设一对照组加入等体积的 RPMI-1640完全培养液，然后加入到96孔培养板中，每孔100 μL，每个样品设 3 个重复，置 5%CO2、37℃培养72 h。在培养结束前4小时，于培养板每孔内加入10 μL MTT(初始浓度为5 mg/mL)继续培养4 h。培养结束后，每孔再加入100 μL 10%十二烷基硫酸钠(SDS)－0.04 mol/L HCl溶液，30 min后用酶标仪于570 nm波长下测定各孔光吸收值(OD值)。

淋巴细胞转化率用刺激指数(SI)表示，SI=ConA刺激孔OD570nm/对照孔OD570nm。

1.5.4 血清特异性OVA抗体水平

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定血清特异性OVA抗体水平。首先用稀释液与OVA按照50∶1混合制成包被液，加入酶联反应板各孔，每孔200 μL，37℃包被2 h。弃去孔内液体后，用洗涤液注满各孔，洗涤3次，每次3 min，然后弃去洗涤液;每孔加入100 μL封闭液封闭1 h，洗涤后得包被平板。将100 μL用稀释液稀释40倍的待检血清加入包被板各孔，每个样本3个重复，37℃反应1 h。再用洗涤液注满各孔，洗涤3次后，每孔加入100 μL HRP－兔抗猪IgG，37℃反应30 min。再用洗涤液注满各孔，洗涤3次后，每孔加入新配制的底物(40 mg OPD溶于100 mL pH 5的磷酸－柠檬酸缓冲液中，临用前加入0.15 mL 30%H2O2150 μL，37 ℃反应 30 min。最后，每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4，终止反应。最后用酶标仪测定450 nm处的OD值。

1.5.5 血清皮质醇水平

采用皮质醇ELISA试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)测定血清皮质醇水平。

1.6 数据统计分析

试验数据经Excel 2003初步整理，然后利用SPSS 11.5统计软件中的一般线性模型(GLM)进行方差分析，对不同ASPS梯度的饲粮处理效应进行线性和二次曲线回归分析，采用Duncan氏法进行多重比较检验，P＜0.05时确定为差异显著。并参照文献［8－9］的分析方法，通过 SPSS 11.5系统的二次曲线回归分析以及broken-1ine分析，求获得最大生长速度的添加水平。

2 结果

2.1 ASPS对断奶仔猪生长性能的影响

由表2可知，各组仔猪的IBW差异均不显著(P＞0.05);500 mg/kg ASPS组和 800 mg/kg ASPS组仔猪的FBW均极显著高于对照组(P＜0.01)，1 000 mg/kg ASPS 组显著高于对照组(P＜0.05)。饲粮中添加ASPS对仔猪的ADFI和F/G影响不显著(P＞0.05)，但能显著提高仔猪的ADG(P＜0.05)，随ASPS添加水平增加，FBW 和ADG均呈二次曲线变化(P＜0.01)，F/G呈线性改善(P＜0.05)。通过对 ADG的broken-1ine分析和二次曲线回归分析可知，获得最大生长速度的添加水平分别为869和728 mg/kg，可见，在本试验条件下，ASPS在断奶仔猪饲粮中的添加量以800 mg/kg为宜。

2.2 ASPS对断奶仔猪腹泻率的影响

由表3可知，饲粮中添加ASPS能显著降低仔猪的腹泻率(P＜0.05)。与对照组相比，饲粮中添加300(P ＜0.05)、500(P ＜0.01)和 800 mg/kg ASPS(P＜0.01)降低了仔猪的腹泻率。通过对不同ASPS梯度的饲粮处理效应进行线性和二次曲线回归分析可知，随ASPS添加水平的增加，腹泻率呈二次曲线变化(P＜0.01)。

表2 ASPS对断奶仔猪生长性能的影响Table 2 Effects of ASPS supplementation on growth performance of weaner piglets

表3 ASPS对断奶仔猪腹泻率的影响Table 3 Effects of ASPS supplementation on diarrhea ratio of weaner piglets

2.3 ASPS对断奶仔猪外周血淋巴细胞转化率、血清特异性OVA抗体和皮质醇水平的影响

由表4可知，饲粮中添加不同水平ASPS能显著提高仔猪外周血淋巴细胞转化率(P＜0.05)。与对照组相比，500 mg/kg ASPS组(P＜0.05)、800 mg/kg ASPS 组(P ＜0.01)、1 000 mg/kg ASPS组(P＜0.05)仔猪外周血淋巴细胞转化率显著或极显著升高。随ASPS添加水平的增加，外周血淋巴细胞转化率呈线性变化(P＜0.01)。饲粮中添加不同水平的ASPS对仔猪血清特异性OVA抗体水平影响均不显著(P＞0.05)。添加ASPS能显著降低仔猪血清皮质醇水平(P＜0.05)，其中，饲粮中添加500、800和1 000 mg/kg ASPS显著降低了仔猪血清皮质醇水平(P＜0.05)，随ASPS添加水平的增加，血清皮质醇水平呈线性变化(P ＜0.01)。

3 讨论

3.1 ASPS对断奶仔猪生长性能的影响

目前，将ASPS应用于断奶仔猪生产中的研究还未见报道，但有将刺五加水提物应用于仔猪生产中的相关报道。例如，刘合军等［10］在饲粮中添加0.1%刺五加水提物显著提高了早期断奶仔猪的ADFI和ADG，并显著防治了早期断奶仔猪腹泻。燕富永［11］研究表明，0.1%刺五加水提物显著提高了仔猪ADG，极显著降低了饲料转化效率(FCR)。本试验结果表明，适宜水平的ASPS能显著提高断奶仔猪ADG和降低仔猪腹泻率，这与前述的研究结果基本一致。但本试验中ASPS对ADFI及F/G无显著影响，这与前述在仔猪饲粮中添加刺五加水提物的效果不一致，究其原因，一方面可能因为刺五加水提物与刺五加多糖的成分差异(刺五加水提物是刺五加中多种成分的混合物，除含有ASPS外，还含有刺五加苷、黄酮、微量元素和氨基酸等)所致;另一方面，可能因为ASPS味辛、微苦，而猪的味觉和嗅觉非常灵敏，这可能是导致ASPS对仔猪ADFI无显著影响的原因。对试验1～21 d ADG的broken-1ine分析和二次回归分析，获得最大生长速度的最佳添加水平分别为869和728 mg/kg，可见，结合本试验ASPS的添加水平，APS在断奶仔猪饲粮中的添加量以800 mg/kg为宜。

表4 ASPS对断奶仔猪外周血淋巴细胞转化率、血清特异性OVA抗体和皮质醇水平的影响Table 4 Effects of ASPS supplementation on peripheral blood lymphocyte proliferation，serum specific ovalbumin antibody and cortisol levels of weaner piglets

3.2 ASPS对断奶仔猪免疫功能的影响

在ASPS影响细胞免疫方面，如谢蜀生等［12］研究表明，在小鼠体内注射ASPS对小鼠全脾细胞以及去T细胞后的脾细胞都有强的促有丝分裂作用;孟繁磊等［13］研究表明，刺五加叶均一多糖组分对体外培养的小鼠脾淋巴细胞增殖具有显著的促进作用。淋巴细胞增殖(转化率)是评价细胞免疫功能的一个重要指标［14］。本试验研究发现，ASPS可以显著提高断奶仔猪外周血淋巴细胞转化率，这与前述的以往研究结果一致，提示ASPS有增强机体的细胞免疫功能的作用，对免疫系统发育还不完善的早期断奶仔猪来说，细胞免疫功能的改善可以在一定程度上增强机体对微生物入侵和疾病的抵抗能力。

在ASPS影响体液免疫研究方面，Han等［15］从刺五加组织培养的果实中分离获得一种均一化多糖可增加小鼠分泌免疫球蛋白M(IgM)的B细胞数量，提示ASPS对小鼠体液免疫功能具有一定影响。本试验通过给仔猪注射OVA抗体使仔猪致敏以评价体液免疫水平，结果表明ASPS对仔猪血清特异性OVA抗体水平影响不显著，提示ASPS对仔猪体液免疫功能影响不显著，这与前述的研究结果不一致，分析这种结果的差异可能是研究动物小鼠和仔猪的种属差异所致。

3.3 ASPS对断奶仔猪断奶应激的影响

皮质醇是由下丘脑－垂体－肾上腺轴分泌的负反馈调节免疫反应的重要成分，其水平高低可作为衡量应激程度的一个重要指标［16］。Founderburke等［17］研究了心理、温度、营养3种应激因素对28日龄断奶仔猪生理和生长的影响，结果发现环境温度应激组仔猪(环境温度从断奶前29℃降至断奶后13℃)比自然吮乳组仔猪增重显著加快，断奶心理应激组和环境温度应激组血液生长激素和胰岛素水平显著升高，而营养应激组仔猪出现失重，血清胰岛素水平显著降低，血清皮质醇水平显著升高。本试验中ASPS使仔猪血清皮质醇水平显著降低，表明ASPS有缓解应激的作用，这也可能是ASPS促进断奶仔猪生长的原因之一。

4 结论

①饲粮中添加ASPS可以显著提高断奶仔猪的ADG，改善血液免疫指标，降低仔猪的应激反应和腹泻的发生。

②在本试验条件下，ASPS在仔猪饲粮中的添加量以800 mg/kg效果最好。

［1］BARNETT K L，KORNEGAY E T，RISLEY C R，et al.Characterization of creep feed consumption and its subsequent effects on immune response，scouring index and performance of weanling pigs［J］.Journal of Animal Science，1989，67(10)：2698 －2708.

［2］HEDEMANN M S，JENSEN B.Variations in enzyme activity in stomach and pancreatic tissue and digesta in piglets around weaning［J］.Archives of Animal Nutrition，2004，58(1)：47 －59.

［3］MCGLONE J，POND W G.Pig production：biological principles and applications［M］.New York：Delmar Learning Inc.，2003：23.

［4］袁学千，王淑梅，高权国.刺五加多糖增强小鼠免疫功能实验研究［J］.中医药学报，2006，32(4)：48 －49.

［5］PARK E J，NAN J X，ZHAO Y Z，et al.Water-soluble polysaccharide from Eleutherococcus senticosus stems attenuates fulminant hepatic failure induced by D-galactosamine and lipopolysaccharide in mice［J］.Basic Clinical Pharmacology Toxicology，2004，94(6)：298 －304.

［6］LEE S，SHIN D S，OH K B，et al.Antibacterial compounds from the leaves of Acanthopanax senticosus［J］.Archives Pharmacal Research，2003，26(1)：40－42.

［7］YOON T J，YOO Y C，LEE S W.Anti-metastatic activity of Acanthopanax senticosus extract and its possible immunological mechanism of action［J］.Journal of Ethnopharmacology，2004，93(2/3)：247 －253.

［8］MCPHERSON R L，WU F J，KIM G S W.Growth and compositional changes of fetal tissues in pigs［J］.Jounal of Animal Science，2004，82(9)：2534 －2540.

［9］JI F，WU G J，BLANTON R，et al.Changes in weight and composition various tissues of pregnant gilts and their nutritional implications［J］.Journal of Animal Science，2005，83(2)：366 －375.

［10］刘合军，孔祥峰，尹富贵，等.刺五加提取物对早期断奶仔猪生长性能和血清生化参数的影响［J］.天然产物研究与开发，2006(18)：993－998.

［11］燕富永.日粮添加刺五加提取物减缓仔猪断奶应激和促生长机理研究［D］.硕士学位论文.武汉：华中农业大学，2008：35 －50.

［12］谢蜀生，吕秀凤，秦凤华，等.刺五加多糖免疫调节机理初探［J］.中华微生物学和免疫学杂志，1989，9(3)：153 －155.

［13］孟繁磊，陈瑞战，魏春雁，等.刺五加叶多糖的分离纯化及免疫活性研究［J］.特产研究，2011(1)：12－15.

［14］LIU Y L，LI D F，GONG L M，et al.Effets of fish oi1 supplementation on the performance and the immunological，adrenal，and somatotropic responses of weaned pigs after an Escherichia coli lipopolysaccharide challenge［J］.Journal of Animal Science，2003，81(11)：2758－2765.

［15］HAN S B，YOON Y D，AHN H J，et al.Toll-like receptor-mediated activation of B cells and macrophages by polysaccharide isolated from cell culture of Acanthopanax senticosus［J］.International lmmunopharmacology，2003，3(9)：1301 －1312.

［16］BERTINI R M，BAINCHI M，GHEZZI P.Adrenalectomy sensitizes mice to the lethal effects of interleukin 1 and tumor necrosis factor［J］.Journal of Experimental Medicine，1988，167(5)：1708 －1712.

［17］FOUNDERBURKE DW，SEERLEYRW.The effects of postweaning stressors on pig weight change，blood，liver and digestive tract characteristics［J］.Journal of Animal Science，1990，68(1)：155 －162.