TaqMan探针实时荧光定量PCR快速检测土拉弗朗西斯菌＊

赵素慧，王春晖，周 莹，韦 耀，韩桂圆，钮红岺，赵 卫，张其威，万成松

土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）能引起土拉热（野兔热），革兰阴性，无孢子［1］。根据生化性质、毒力和地理分布，分为4个亚种，土拉热亚种（F.tularensissubsp.tularensis）主要集中在北美地区，全北区亚种（F.tularensissubsp.holarctica）主要分布在北美、欧洲和亚洲［1－2］，中亚细亚（F.tularensissubsp.mediaasiatica）与新凶手亚种（F.tularensissubsp.novicida）主要分布在北美洲，在澳大利亚也有所发现［3－4］，我国以全北区亚种为主［5］。1957年，我国在黄鼠体内分离到土拉弗朗西斯菌。1959年黑龙江省报道了第一起人间 “野兔热”［6］。1986年山东某肉类加工厂暴发了人间“野兔热”［7］。土拉弗朗西斯菌以节肢动物叮咬、空气和接触传播为主［8］，通过黏膜或昆虫叮咬侵入临近组织，引起炎症病变反应，在巨噬细胞内寄生，并扩散到全身淋巴和组织器官，引起淋巴结坏死和肝脾脓肿，在临床上表现为发热、黄瘟等，严重者死亡。

本研究选择具有良好抗原性的土拉弗朗西斯菌FopA外膜蛋白［9］人工合成fopA基因保守序列，旨在建立一种灵敏度高、特异性强、快速准确地检测土拉弗朗西斯菌的TaqMan探针荧光定量PCR方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与样品 伤寒沙门菌“H”株（H901 50097）和炭疽芽孢杆菌减毒株（63002）由北京军事医学科学院惠赠；金黄色葡萄球菌（ATCC6538）、肠出血型大肠埃希菌O157∶H7（883）和DH5ɑ由本实验室保存，所有细菌操作均在二级生物安全实验室（BSL-2）内进行。土拉弗朗西斯菌阳性模拟模板（fopA基因保守序列）由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.1.2 试剂与耗材 pUC57（Amp＋）载体为 Promega公司产品；质粒小提试剂盒为Omega Bio-Tek公司产品；Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）为TaKaRa公司产品，DNA marker、2×Taq Master Mix为OMEGA公司产品；……