大螟幼虫田间扩散及成虫飞行能力研究

韩兰芝， 彭于发， 吴孔明

（中国农业科学院植物保护研究所／植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193）

转基因抗虫水稻已在日本和东南亚的多个国家进行了田间试验，2005年伊朗首次批准了Bt水稻的商业化种植［1]。我国也于2009年8月17日发放了转cry1Ac／cry1Ab基因水稻（‘华恢1号’及其转基因杂交稻‘Bt汕优63’）在湖北省生产应用的安全证书 （http：∥www.stee.agri.gov.cn／biosafety／spxx／）。一般而言，Bt杀虫晶体蛋白的种类不同，其杀虫谱也不同［2－4]。Bt水稻中转入的Bt基因所表达的杀虫蛋白对螟蛾科的靶标害虫二化螟、三化螟和稻纵卷叶螟均具有较高的控制效果，但对夜蛾科类的大螟（又名稻蛀茎夜蛾）防效明显下降［5－8]。有报道，转cry1Ac＋CpTI晚稻对大螟的虫口减退率为44%～64%，转基因水稻田残存鳞翅目幼虫中，大螟所占比例明显升高，可能会引起转基因稻田主要害虫构成比例发生变化［8]。大螟对Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ba等不同Bt毒蛋白的耐受性要远远高于二化螟［9]。由此可见，转基因水稻产业化后，大螟对Bt水稻的抗性风险要高于二化螟等其他鳞翅目害虫。因此，大螟的抗性治理将成为Bt水稻害虫抗性治理研究中的重要内容。

“高剂量／庇护所”策略是目前害虫Bt抗性治理中被广泛接受的主要治理措施［10－11]。其原理为在Bt作物周围种植一些非Bt作物，作为敏感害虫的庇护所，使敏感个体与Bt植株上的抗性个体随机交配，产生的杂合子后代在Bt植株上不能存活，从而达到治理害虫的目的。实施该策略的前提条件之一是Bt作物上的抗性个体与庇护所中的敏感个体必须自由交配［10－11]。而要实现该条件，必须首先了解成虫的飞行能力，从而确定庇护所与Bt田的距离［12]。同时，庇护所与Bt稻田呈何种分布形式也是害虫抗性治理策略中首要考虑的关键问题，它主要取决于幼虫在田间的取食和运动特性［13－15]。有研究表明，非水稻寄主植物茭白、玉米和一些莎草科植物在大螟的抗性治理中可作为天然庇护所［16]，但与大螟抗性治理相关的运动行为如幼虫在田间的迁移扩散和成虫的飞行能力还未见报道。这些研究的系统开展，将有助于实施预防性的大螟抗性治理策略，对Bt水稻的可持续应用和健康发展均具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

从福州郊区水稻田采集虫龄一致的大螟幼虫，用稻茎在室内饲养至化蛹。羽化后一部分成虫置于移栽有水稻苗的交配笼中产卵，产卵后，将所产的卵块从交配笼中取出，放入铺有湿滤纸的培养皿中，直至卵块变黑，接到田间小区，至幼虫孵化，用于观察其迁移扩散能力；另一部分成虫羽化后直接用于飞行能力测试，所有试虫的饲养条件均保持在（27±1）℃，70%～80%RH，L∥D＝14h∥10h。

1.2 大螟幼虫在田间的迁移扩散能力研究

1.2.1 田间试验小区的设置

本试验于2006年在福建省农业科学院吴凤试验基地（福州市郊）的网室中进行。供试水稻生育期分别为分蘖期和孕穗期。每一生育期测试均设置24个小区，共计48个小区，每小区面积为4m×4m。随机区组设计，小区间隔为1m。供试水稻品种为华南稻区的主栽籼稻‘明恢86’。供试生育期为分蘖期的水稻于2006年7月15日播种，8月7日左右插秧；供试生育期为孕穗期的水稻于6月8日播种，6月30日左右插秧移栽；秧苗均为每穴单株移栽，穴间距为20cm。各试验小区内的水肥管理和农事操作相同，在整个生长期内不施任何农药。

1.2.2 人工接虫及取样方法

由于该试验在基地的网室中进行（为防止外来虫源入侵，在网室外围又加一层80目的纱网），插秧初期，由于纱网的阻隔，极少有外来虫源的自然入侵，随着大螟发生数量的增加，纱网也很难完全阻隔外来虫源的自然入侵。因此，人工接虫前，对每一小区的自然入侵情况进行调查，发现自然入侵的大螟均已发育到3～4龄，可与人工接的试虫区别开来，故在以后的破坏性取样记录虫量时，要减去自然入侵的虫量。

分蘖期和孕穗期的人工接卵日期分别为播种后35～40d和70～75d，即8月22日前后和8月20日前后；接虫方法：将变黑的卵块接到每个试验小区的中心穴上，每一中心穴接卵100～200粒左右，将卵块放于中心穴的第2和第3个叶片之间，并做好标记（该接虫穴又称作释放穴）。接虫后，观察记录每块卵孵化的具体日期。幼虫孵化后，每隔2d调查1次各小区的幼虫在田间的扩散情况，若发现释放穴已有试虫扩散到邻近的水稻穴上，则开始进行破坏性取样。取样方法参照Cohen等［14]的方法并做适当修改。每次取样约重复3～4次。据田间观察发现，在接虫后的第8天有极少量幼虫开始向邻近的水稻穴上扩散，故在接虫后的第9、12、15、22、28、33天分别取样，这时80%左右的幼虫已开始化蛹。取样时，将整个小区内的水稻穴从土中完全拔出，仔细清除根部，洗净，并对每株水稻按距离的不同做好标记，放入塑料袋中带回室内进行剥查。若当天来不及调查，可先放入4℃冰箱中保存，待查。在剥查时，记录每一穴水稻中幼虫的数量和所在位置及每一穴水稻的分蘖数。

1.3 大螟成虫的飞行能力测定

测试仪器为中国农业科学院植物保护研究所研制的32通道昆虫飞行数据微机采集系统。测试前，先用乙醚轻度麻醉大螟处女蛾，然后用毛笔轻轻刷去前胸背板的鳞片，再用502胶（苏州化工厂研制）粘接于飞行磨吊臂的小铜丝上。供试的大螟为不同日龄的处女蛾，每次的测试时间为12h，从每天的18：00开始至次日6：00结束。测试结束后，将存活的成虫从飞行磨上取下，放入小塑料培养皿中，饲喂蜂蜜水，在当天18：00继续进行吊飞测试，如此一直测试到成虫死亡或飞不动（将其放在飞行磨上，用手触动，仍不飞）为止。飞行测试在（24±1）℃，70%～80%RH，完全黑暗的条件下进行。整个测试过程中共吊飞163头试虫。

1.4 数据统计与分析

采用两个参数来描述幼虫在田间扩散时随时间变化的空间分布。（1）幼虫在水稻穴上的回收率，其计算方法为取样穴上的幼虫数／总回收虫数；（2）幼虫扩散的平均距离，将在某一特定距离回收的幼虫数分别记为n1、n2……，某一特定的扩散距离记为d1、d2……，扩散的平均距离＝（n1×d1＋n2×d2＋ni×di）／总回收虫数。

大螟在分蘖期和孕穗期水稻上同一取样日的平均扩散距离的比较采用t测验；两生育期在不同取样日的平均扩散距离的多重比较采用Fisher氏最小显著差数法（LSD）进行。

成虫的飞行数据（飞行距离、时间及速度）均采用飞行磨自带的软件进行初步的分析汇总后［17]，在Excel中计算其平均飞行距离、平均飞行持续时间及平均飞行速度。进行多重比较之前，需将成虫的飞行数据进行对数转换，经正态性检验后，用Fisher氏最小显著差数法（LSD）对不同日龄成虫的平均飞行能力进行差异显著性比较。所有数据的统计分析均在SAS软件上完成［18]。

2 结果与分析

2.1 大螟幼虫在田间的迁移扩散能力

在分蘖期和孕穗期的水稻上，接虫后的1～7d幼虫均在释放穴的分蘖上扩散；接虫后第8天，少量幼虫开始向邻近穴扩散；接虫后的第9天，约27.8%和17.3%的幼虫分别扩散到距离释放穴20cm处的邻近穴上；到第12天，已分别有18.7%和3.4%的幼虫扩散到距离释放穴40cm的水稻穴上；第15天，分蘖期水稻上已有7.3%的幼虫扩散到距离释放穴60cm处的水稻穴上；第22天，分蘖期水稻上已分别有15.6%和9.0%的幼虫扩散到距离释放处80cm和100cm的水稻穴上；而在孕穗期水稻上，只有8.2%的幼虫扩散到100cm处的水稻穴上；第28天，6.4%的大螟在分蘖期水稻上扩散到120cm处，而孕穗期水稻上只有8.9%的大螟扩散到100cm的水稻穴上；第33天，约9.1%和5.9%的大螟幼虫在分蘖期和孕穗期水稻上均扩散到120cm处（图1）。

大螟在不同取样时间的扩散距离差异显著（分蘖期F＝554.33，df＝5，18，p＜0.01；孕穗期F＝347.42，df＝5，17，p＜0.01）。在整个幼虫发育过程中，大螟在分蘖期和孕穗期水稻上所能扩散的最远距离均为120cm，平均扩散距离分别为62.29cm和51.02cm。且大螟在分蘖期水稻上不同取样日期的扩散距离均显著高于孕穗期（t＝2.97，df＝3，3，p＜0.05，第9天；t＝4.56，df＝3，3，p＜0.01，第12天；t＝8.05，df＝3，3，p＜0.01，第22天；t＝6.15，df＝3，3，p＜0.01，第28天；t＝7.06，df＝3，3，p＜0.01，第33天）（表1，图1）。

表1 大螟幼虫在田间的平均扩散距离1）

接虫后1～9d，大多数幼虫均在3龄以下，在释放穴上的数量变化较小；接虫12d后，大多数幼虫发育到3龄以上，释放穴上的虫量显著下降，至33d在分蘖期和孕穗期水稻释放穴上的虫量仅有5.6%和17.9%，且大多数均为一直在释放穴上取食的幼虫，即将化蛹或已化蛹（图1）。

图1 大螟幼虫田间迁移时随时间变化的空间分布

2.2 大螟成虫的持续飞行能力

持续吊飞结果表明，大螟的有效飞行时间为4～5d，能连续多次飞行。试虫起飞比率为53.4%，其中累计能飞行12h的个体占54.0%，其累计平均飞行距离、飞行速率和飞行时间分别为5.66km、1.60km／h和3.25h；累计能飞行24h的个体占21.8%，其累计平均飞行距离、飞行速率和飞行时间分别为8.67km、2.10km／h和4.21h；约有12.6%的个体能累计飞行36h，其累计平均飞行距离和飞行时间分别达11.53km和5.44h；约有5.7%的个体能连续飞行48h，其累计平均飞行距离和飞行时间分别超过13km和6h，显著高于连续3晚的飞行距离和时间（F＝12.20，df＝4，82，p＜0.05；F＝15.77，df＝4，82，p＜0.05）。累计飞行60h后，大多数个体已死亡，但少数个体（5.7%）仍具有一定的飞行能力。不同飞行时间的大螟平均飞行速率均以第1晚的较低，但它们之间没有显著差异（F＝2.25，df＝4，82，p＞0.05）（表2）。

2.3 不同日龄大螟成虫的飞行能力

不同日龄大螟的吊飞结果表明，成虫的飞行能力在不同日龄间存在显著差异（表3）。初羽化成虫就具有一定的飞行能力；2日龄时飞行能力达到最强，平均飞行距离为10.27km，显著高于1日龄和4日龄（F＝3.00，df＝3，112，p＜0.05），平均持续飞行时间可达3.62h，显著高于4日龄（F＝3.62，d f＝3，112，p＜0.05），平均飞行速度为3.70km／h，仅次于3日龄；3日龄的成虫仍具有较强的飞行能力，虽然其平均飞行距离和平均飞行持续时间低于2日龄，但其平均飞行速度达到最大（5.29km／h）；4、5日龄后，成虫的飞行能力显著下降。

表2 持续吊飞时大螟的飞行能力

表3 大螟不同日龄处女蛾的飞行能力

3 讨论

本研究结果表明，大螟幼虫在不同水稻穴之间存在频繁的迁移扩散行为，且在分蘖期水稻上的扩散速率显著高于孕穗期。同样，Cohen等［14]在研究二化螟和三化螟幼虫在温室和田间的扩散速率时，也发现两种害虫在分蘖期水稻上的扩散速率和距离均高于孕穗期水稻，且在温室的扩散速率和距离高于田间。究其原因，可能与水稻植株分蘖的数量有关，一般水稻植株的分蘖数在孕穗期达到最高，其数量是分蘖期的1.1～2.0倍。另一方面大螟的扩散速率也反映了其对营养条件的需求状况［14]。孕穗期的水稻生长繁茂，每个分蘖茎秆的直径也达到最大，能给幼虫提供更多的食物资源和生存空间［14]。因此，幼虫有充足的食料进行生长发育，无需为了食物而频繁迁移，故其扩散速率和扩散距离大大降低。除此之外，田间的气候对幼虫的迁移也有重要影响，如初孵幼虫可以借助风力快速地扩散；气温也是一个很重要的因素，温度高，幼虫发育速率加快，需要获取更多的食物满足其生长发育，因此其必须转移到新的植株上进行危害，从而加快了其扩散的速度和距离［14－15]。本研究还表明，在接虫后1～9d内，70%和80%以上的幼虫分别分布在分蘖期和孕穗期水稻的释放穴上，并在释放穴的各个分蘖上扩散取食，这时幼虫大多数还在3龄以下，取食量较小，对食物资源和生存空间的需求量较小，所以扩散速度较慢；接虫12d后，释放穴上的幼虫数量显著下降，这时幼虫大多均发育到3龄以上，取食量显著增大，对食物质量、数量及生存空间的要求也增高。因此，扩散速率显著加快。这些均说明大螟不但在穴与穴之间存在高频次的迁移，而且在同一穴内的不同分蘖上也存在高频次的扩散，且扩散速率随虫龄的增大而加快。

大螟这种频繁的扩散行为将直接导致幼虫在Bt植株与非Bt植株间的频繁移动，有助于加速害虫对Bt作物的抗性进化，这在许多模型研究中已得到证实［11，19]。虽然昆虫在Bt与非Bt作物间的移动在一定程度上降低了选择率，但抗性显性度的增加远远超过了选择率的降低，因此有助于加快抗性演化［19]。此外，昆虫在Bt与非Bt作物间的移动可能影响抗性和敏感基因型个体的相对适合度。Cohen等［14]和Dirie等［15]在研究二化螟和三化螟在Bt水稻和非Bt水稻的扩散行为试验中得出：种子混合的庇护所策略可能提高抗性个体的存活和适应性。虽然大螟在两生育期的水稻上的平均最大迁移距离为62.29cm和51.02cm，但均在距离释放穴120cm处的水稻穴上回收到大螟，这说明其最大迁移距离为120cm。对害虫抗性治理来说，如果在不同田块之间种植非Bt水稻作为庇护所，那么害虫的最大迁移距离也是考虑的重要因素之一［14]。因为对大龄幼虫来说，它完全可以通过爬行等方式在不同田块之间进行扩散。

由于大螟成虫白天多隐蔽、不活动［20]，故本文只模拟其晚上的飞行条件并测试其一晚的飞行距离，持续飞行能力测试的是其数晚的累计飞行距离。本研究结果表明，大螟累计飞行距离≤5km的个体占75.5%。不同日龄成虫的飞行能力具有显著差异，飞行能力在2日龄达到最高，3日龄仍较强，4日龄后飞行能力显著下降，与孙建中等［20]的结果基本相符。但值得注意的是，不同日龄成虫的起飞比例却差异不大，均在50%左右，可见仍有一半左右的个体不能起飞。又由于大螟求偶前期特别短，羽化后当晚或次晚就可交配，并且交配率在第2天达到最高［20－21]。因此，在用“高剂量／庇护所”策略对大螟进行抗性治理时，为保证敏感个体与抗性个体的充分自由交配，必须考虑庇护所与Bt稻田的距离。鉴于大螟幼虫迁移扩散能力相对较强、飞行能力相对较弱（累计飞行距离≤5.0km的个体占75.5%）和求偶前期相对较短（0～2d）的前提下，我们认为：对大螟进行抗性治理时，应采用分区种植的庇护所，且庇护所与Bt稻田的距离最好不超过5.0km。

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