华北大黑鳃金龟气味受体OrCo基因的克隆及序列分析

王 冰， 尹 姣， 李克斌， 曹雅忠

（中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193）

昆虫在长期进化过程中形成灵敏的嗅觉机制，以适应复杂多变的环境条件，从而得以生存繁衍。昆虫对气味分子的识别和鉴定包括一系列的过程，即脂溶性小分子化合物的气味物质借助气味结合蛋白（odorant－binding proteins，OBPs）等小分子量触角蛋白的携带，穿过气—液相界面到达嗅觉受体（olfactory receptors，ORs），在触角嗅觉受体内完成对气味的识别［1－2]。1981年昆虫气味分子结合蛋白的发现以及其功能探讨，迈出了对嗅觉机制研究的第一步［3]。1991年，Buck和Axel首次在哺乳动物鼠中分离出了嗅觉受体［4]。而昆虫嗅觉受体的研究起步较晚，1999年在黑腹果蝇（Drosophila mela－nogaster）中发现了第一个昆虫气味受体［5]，为昆虫嗅觉蛋白功能的研究以及气味分子识别机制奠定了基础。昆虫气味受体分为传统气味受体（conventional receptor）和OrCo（曾经被称为Or83b）受体（olfactory receptor coreceptor）［6]。前 者 基 因 在 不同昆虫间同源性较低，目前已有的研究显示只在较小部分昆虫物种间获得；而后者基因是一类非典型气味受体，在不同种间高度保守，与传统的气味受体共同行使嗅觉功能［7－9]。同时也有研究表明，OrCo受体对传统的气味受体在膜结构上的正确定位起着不可或缺的作用［10]。

近年来，由于作物种植结构和耕作制度的调整等原因导致地下害虫频频暴发，对我国的农业生产安全造成重大的威胁［11]。鞘翅目金龟甲类昆虫是国内外公认的难以防治的土栖性害虫，其中比较特殊的类群—华北大黑鳃金龟［Holotrichia oblita（Faldermann）]在我国发生相当严重，是金龟子类害虫中防治的难点［12]。金龟子类害虫的幼虫主要集中在地下危害，防治困难，而成虫一般在地面活动，防治方法相对简便，因此，寻求对成虫的有效防治方法成为了科学家们近年来研究的热点。金龟子在寻找寄主、配偶，搜寻产卵及生殖场所等过程中，虫体同外界的化学信息交流密切，其中嗅觉在此过程中具有重要的作用［13]。因此，对其成虫嗅觉系统的深入研究可成为控制其幼虫为害的突破点。目前，现有的研究发现，昆虫对成千上万种气味分子的识别主要依赖于气味受体介导的气味分子与嗅觉神经的专一性结合。因此，研究气味受体的特性、变异及专一性对于阐明嗅觉识别的分子机理是非常重要的［14－15]。本研究采用PCR克隆和RACE延伸技术获得了华北大黑鳃金龟子非典型受体蛋白OrCo基因，并对其进行序列分析，为深入研究华北大黑鳃金龟嗅觉机制打下基础。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

试虫华北大黑鳃金龟成虫于2011年5月在河北省沧州市郊区采集。将试虫成虫的触角用刀片切下，立即置于液氮中速冻，之后于－80℃保存。

1.2 主要试剂

总RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司；PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、5′－Full RACE Kit、3′－Full RACE Core Set Ver.2.0、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒、LA Taq酶购自宝生物工程有限公司（TaKaRa）；感受态细胞Trans5αChemically Competent Cell购自全式金公司；pGEM－T Easy vector购自Promega公司；抗生素类、X－gal、IPTG购自Sigma公司；其余试剂均为国产或进口分析纯试剂。引物合成由上海生工公司完成；测序由华大基因生物技术公司完成。

1.3 试验方法

1.3.1 华北大黑鳃金龟触角总RNA的提取

取50头华北大黑鳃金龟成虫，剪下触角，于液氮中研磨，根据Trizol提取RNA说明书提取总RNA，之后加入RNase－free水30μL，立即进行cDNA第1链合成或－80℃保存。

1.3.2 cDNA第1链合成

以总RNA为模板，按照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行反转录，合成cDNA第1链。反应步骤如下：将下列物质混合：Oligo dT Primer（50μmol／L）1μL，dNTP 1μL，总 RNA 6μg，RNase free dH2O 2μL，之后在PCR仪上进行65℃5min变性、退火反应，于冰上急冷。配制反转录反应液，包括5×PrimeScriptTMBuffer 4μL，RNase Inhibitor（40U／μL）0.5μL，PrimeScriptTMRTase（200U／μL）1μL，上述变性、退火后反应液10μL，RNase Free dH2O 4.5μL，在PCR仪上按下列条件进行反转录反应：42℃60min，70℃15min，冰上放置。将合成的cDNA于－20℃保存。

1.3.3 引物设计与合成

根据GenBank中已经登录的近缘种金龟子Or－Co基因的保守区域，利用引物设计软件Primer Premier 5设计相应的简并引物，用于扩增华北大黑鳃金龟OrCo受体基因的cDNA片段。3′RACE和5′RACE引物是根据cDNA扩增片段获得的序列而进一步设计的。最后设计特异性引物扩增OrCo受体基因的全长。引物序列见表1。

表1 扩增华北大黑鳃金龟OrCo基因所用引物

1.3.4 PCR扩增和RACE反应

以合成的cDNA为模板，选用LATaq酶扩增。混匀下列成分：合成的cDNA 2.5ng，dNTP Mixture 8μL（各2.5mmol／L），10×LA PCR BufferⅡ（Mg2＋free）5μL，25mmol／L MgCl25μL，正向引物和反向引物各1μL（20μmol／L），LA Taq DNA 聚 合 酶（5U／μL）0.5μL，加灭菌蒸馏水至50μL，放入PCR仪进行扩增。PCR反应条件：94℃变性5min；30个循环条件为94℃30s，55℃30s，72℃1min的循环；72℃延伸10min。

RACE 反应参照5′－Full RACE Kit和 3′－Full RACE Core Set Ver.2.0说明书。扩增的产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测并对目的片段进行回收。

1.3.5 PCR产物克隆及序列测定

按说明书的说明，将PCR回收产物连接到pGEM－T Easy vector上，然后转化到大肠杆菌Trans5αChemically Competent Cell，进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆，之后送公司测序。

1.3.6 序列分析

Blast同源性搜索在NCBI网站进行，序列分析由DNAman软件完成，跨膜域预测由TMHMM程序（http：∥www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM）完成。多序列同源性比对和结果输出应用Clustal 2.0.7软件进行。昆虫气味受体进化树的构建使用Mega4.1软件进行。

2 结果与分析

2.1 华北大黑鳃金龟OrCo基因的克隆

以反转录获得的cDNA为模板，利用简并引物对其进行PCR扩增，获得450bp左右的片段，与pGEMT Easy vector连接，并转化大肠杆菌Trans5α细胞，对其进行菌液PCR，检测片段大小正确后测序。获得的片段序列在NCBI网站上进行BLAST同源搜索，比对结果显示该片段与鞘翅目嗅觉受体基因高度同源。根据获得的序列分别设计3′－RACE和5′－RACE所需的特异性引物（见表1），并根据说明书进行扩增，结果得到了580bp和1 300bp的特异性条带，同样将这些片段进行连接，转化与测序。

根据3′－RACE和5′－RACE测序结果，拼接获得一个编码华北大黑鳃金龟OrCo的cDNA序列。同时，我们设计了1对特异性引物（见表1）来证明PCR，3′－RACE和5′－RACE片段是来源于同一个基因，PCR扩增得到了一条全长为1 598bp的序列，测序结果与拼接结果一致（图1）。该序列蛋白编码区长1 434bp，5′非翻译区长203bp，3′非翻译区不完整，但是得到了终止密码子TAA以及多聚腺苷酸信号序列，因此蛋白编码区是完整的。

图1 华北大黑鳃金龟OrCo基因（Hobl／OrCo）PCR扩增结果

2.2 序列分析

将克隆获得的华北大黑鳃金龟cDNA全长序列命名为Hobl／OrCo，并在GenBank注册，登录号为：JF718 662。如图2所示，Hobl／OrCo基因的核苷酸序列全长共1 598bp，开放阅读框全长1 434bp，编码477个氨基酸。根据网站http：∥www.expasy.ch／tools／protparam.html预测其分子量为54.54ku，等电点为7.65。跨膜结构分析（http：∥www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM）表明，Hobl／OrCo基因推断的氨基酸序列具有7个α螺旋跨膜区，跨膜位置分别为37～59、74～96、135～157、194～216、339～361、381～403、451～473（图3），类似于一个典型的G蛋白偶联受体。

图2 华北大黑鳃金龟Hobl／OrCo核苷酸序列及推导的氨基酸序列

图3 华北大黑鳃金龟Hobl／OrCo跨膜区预测

以往的研究表明OrCo受体在昆虫进化过程中高度保守，因此选取已知近缘种鞘翅目的铅灰齿爪鳃金龟（Hplu／OrCo）、赤拟谷盗（Tcas／OrCo）和黄曲条跳甲（Pstr／OrCo），以及鳞翅目、双翅目和膜翅目具有代表性的昆虫与其进行序列联配。结果显示，Hobl／Or－Co基因的氨基酸序列与近缘种铅灰齿爪鳃金龟（Hplu／OrCo）的同源性高达95.39%，与鞘翅目赤拟谷盗（Tcas／OrCo）同源性高达80.71%，与已经报道的其他昆虫的嗅觉受体同源性在76%以上，尤其在C端保守性非常高，这与以往的研究高度吻合（图4）。

利用Mega 4.1软件［16]构建了鳞翅目、鞘翅目、膜翅目、双翅目部分昆虫非典型气味受体的系统进化树（图5）。经1 000次重复后，该进化树非常直观地呈现出4个目昆虫之间的进化关系。结果显示，22个OrCos分成2个大的分支，其中双翅目和鞘翅目昆虫处于一个分支上，而膜翅目和鳞翅目昆虫处于另一个大分支上，说明相对于膜翅目和鳞翅目而言，双翅目与鞘翅目在OrCo上的亲缘关系较近。这4个目的气味受体序列均表现得相对较为保守，未出现较大的分化。在鞘翅目中，大黑鳃金龟（Hobl／Or－Co）与铅灰齿爪鳃金龟（Hplu／OrCo）的非典型气味受体亲缘关系很近，与黄曲条跳甲（Pstr／OrCo）则相对远些，这与序列联配的结果相一致。

3 讨论

对果蝇（Drosophila melanogaster）、冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）、意大利蜜蜂（Apis mellifera）、烟芽夜蛾（Heliothis virescens）、家蚕（Bombyx mori）、埃及伊蚊（Aedes aegypti）和赤拟谷盗（Tribolium castaneum）等多种昆虫研究发现，普通气味受体基因在昆虫中同源性很低［9，17－24]。但是另一类非典型气味受体基因OrCo则不同，这类基因在不同昆虫体内高度保守［25]。目前，已经在鳞翅目、膜翅目、鞘翅目、双翅目［22，26－27]等4个目昆虫中发现 Or－Co的存在。本研究利用基因克隆技术成功获得了华北大黑鳃金龟OrCo基因的cDNA全长序列，并进行了序列分析，获得的氨基酸序列与近缘种铅灰齿爪鳃金龟嗅觉受体的同源性高达95%以上，与鞘翅目赤拟谷盗的同源性高达80%以上，这些都与OrCo基因在不同昆虫体内的高度保守性相吻合［28－33]。

目前研究显示OrCo可加速受体与气味分子间的相互作用［8－9，22，34]，并能辅助传统气味受体正确定位到嗅觉神经元树突膜上［8]。OrCo基因与传统气味受体间的互作研究，有助于发掘和研究传统气味受体的相关功能，为进一步探索受体在气味识别过程中所起的作用和功能提供了理论基础。但是，完整的嗅觉受体信号传导机制尚不清楚［35]。2008年在《nature》发表的两篇文章提出了一种新的嗅觉传导模型，即OR－OrCo和气味化合物共同控制的离子通道［36－37]。该研究显示昆虫的化学传导机制可能与其他脊椎动物的有所不同。经典的G蛋白偶联受体的膜拓扑结构呈现为：蛋白的N末端位于细胞膜外，C末端位于细胞膜内。然而，果蝇的膜拓扑结构则与传统的G蛋白偶联受体相反，这样与配体结合的ORs就受到了更多的限制［34]。如果所有果蝇的ORs都呈现出反向G蛋白偶联受体的特征，那么它们将代表另一种7个跨膜结构域蛋白家族。同时，它们的信号传导途径可能与G蛋白偶联受体不同，可能利用磷脂肌醇（IP3）信号通路抑或是环核苷酸信号通路将配体信息传导到受体神经元上，刺激电生理活动［38]。因此，当嗅觉受体与气味配体结合后是如何传导信号的尚需进一步的研究与验证。

华北大黑鳃金龟OrCo受体的成功克隆，对进一步研究华北大黑鳃金龟气味受体的功能以及解析嗅觉机制具有重要的意义。同时，从应用角度来看，由于OrCo基因在昆虫中普遍存在以及其在嗅觉机制中的重要性，使其成为切断嗅觉识别途径的分子靶标，对其深入研究将为农业害虫的防控提供新的理论基础，并具有一定的实践意义。

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