海洋放线菌M1D14代谢产物对几种重要植物寄生线虫的抑制作用

田 阳， 李 平， 张 莉， 孙建华＊， 高丙利

（1.天津师范大学生命科学学院，天津市细胞遗传与分子调控重点实验室，天津 300387；2.浙江东奇生物科技有限公司，湖州 313000）

植物寄生线虫的分布非常广泛，其种类已达200多属5 000多种，每一种植物至少被一种线虫寄生［1]。植物寄生线虫对农业生产危害严重，全世界每年因线虫危害给粮食和纤维作物造成的损失约为12.7%，对蔬菜、花生、烟草和果树造成的损失超过20%，直接经济损失达780亿美元［2]。根结线虫、大豆孢囊线虫和松材线虫是农林生产中危害十分严重的植物寄生线虫，目前已成为农林生产上的重要病原物［3]，其中根结线虫感染一般可造成作物产量损失10%～20%，高的达70%以上［4]。近年来，利用生物防治技术控制线虫病害成为国际研究的热点。生防微生物的应用是防治植物寄生线虫病的重要手段，是保护生态环境，实现农业可持续发展的有力保证［5－7]。

在线虫的生物防治中，抗生素的应用是较为有效的防治途径之一。放线菌是抗生素的重要来源之一，其在自然界中广泛分布于各种不同的自然生态环境里，种类繁多、代谢功能各异，是一类有着广泛实际用途的生物资源［6]。1993年美国Willian Fenical［8]首先提出海洋微生物是一个新的化学研究资源，将成为新的研究热点。海洋放线菌产生的抗生素，不仅结构新颖而且活性代谢产物也是最多的，其中90%以上的海洋放线菌活性产物来自于链霉菌属，仅有少量的来自于放线菌的其他菌属［9]。利用海洋放线菌的代谢产物控制线虫病害成为防治植物线虫病的重要发展方向［10]。目前有很多利用海洋真菌代谢产物杀线的报道，但杀线虫种类单一［11]。利用海洋放线菌代谢产物防治线虫的报道不多，本研究是利用海洋放线菌代谢产物对多种植物寄生线虫进行研究，对于有效利用海洋放线菌具有一定的意义。

海洋放线菌M1D14是课题组筛选出的具有较高杀线虫活性的生防菌株。本试验着重对其进行杀线虫谱研究并初步对其杀线虫机理进行探索。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

海洋放线菌M1D14菌株由浙江东奇生物科技有限公司提供。

1.1.2 培养基

（1）察 氏 培 养 基 标 准 配 置 为 NaNO32g／L，K2HPO41g／L，MgSO4·7H2O 0.5g／L，KCl 0.5g／L，FeSO4·7H2O 0.01g／L，琼脂15g／L，葡萄糖36g／L。

（2）YE培养基标准配置为酵母膏4g／L，麦芽精10g／L，葡萄糖4g／L，琼脂3g／L。

（3）M8培养基标准配置为可溶性淀粉20g／L，葡萄糖10g／L，酵母膏2g／L，酪蛋白水解物4g／L，牛肉膏2g／L，CaCO33g／L。

1.1.3 供试线虫

（1）松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus），由天津师范大学提供。

（2）南方根结线虫（Meloidogyne incognita）2龄幼虫，由浙江东奇生物科技有限公司提供。

（3）大豆孢囊线虫（Heterodera glycines）2龄幼虫，由浙江东奇生物科技有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 海洋放线菌菌株的获得及发酵液制备

（1）海洋放线菌菌株M1D14的纯化：将保藏的菌种画线转接至平板上，28℃，培养5～7d。

（2）海洋放线菌菌株M1D14的种子培养：挑取纯化菌株至YE种子培养液中，28℃，200r／min，振荡培养3d。

（3）海洋放线菌菌株M1D14的发酵培养：配制发酵培养基，将种子液按1∶10比例转接至M8培养液中，28℃，200r／min，振荡培养7d。将发酵液用甲醇萃取，旋转蒸发浓缩后，放入－10℃冰箱保存。

1.2.2 南方根结线虫卵悬液的制备

采用改良的振荡法分离法［12－13]。取温室里接种南方根结线虫60d后的番茄的根，将根剪成1～2cm的小段；放于200mL 1%的次氯酸钠溶液中，在豆浆机中搅拌剪切1～4min；将悬浮液快速经100目、300目和500目的网筛，上下振荡网筛，在500目的网筛上即可收集到游离的卵；随即快速用无菌水冲洗500目筛网上的卵，以除去残留的次氯酸钠；再次冲洗振荡根段以获取更多的卵，用过筛法收集到离心管中，在底部加入40%蔗糖溶液20mL梯度离心，3 500r／min，5min，吸取界面溶液过500目筛，用水冲洗筛子去除蔗糖，反向将卵冲入三角瓶中。加水制成卵悬液，置于4℃冰箱中备用。

1.2.3 供试线虫的制备

（1）南方根结线虫2龄幼虫（J2）的制备：将上述南方根结线虫卵悬液置于自制孵化器中，加无菌水放置在25～28℃环境条件下孵化；4d左右会孵出大量的J2，收集到灭菌三角瓶中，置于4℃冰箱中备用。

（2）松材线虫幼虫的制备：在无菌操作条件下，将灰葡萄孢（Botrytis cinerea）接种于察氏培养基上，21℃下避光培养7d，待菌丝长满培养皿后，将松材线虫接种于该菌丝上进行培养繁殖，26℃下避光培养5～7d［14]。通过贝尔曼漏斗法收集松材线虫［15]，无菌水离心洗涤3次，2 000r／min离心3次，每次3min。用无菌水将离心得到的松材线虫稀释为1 000头／mL的悬液备用。

（3）大豆孢囊线虫J2的制备：将大豆品种‘黑60’种植在温室的病原土壤中，孢囊成熟后挖出根系和根系周围土壤，用过筛法［1]分离孢囊，选取新鲜饱满成熟的褐色孢囊放在自制孵化池中用0.5%次氯酸钠溶液消毒3min，再用无菌水冲洗3遍，加入自制孵化池中，在25℃4mmol／L ZnCl2溶液中孵化。4d左右会孵化出大量的J2，收集至灭菌的三角瓶中，置于4℃冰箱备用。

1.2.4 M1D14杀线活性测定

1.2.4.1 不同浓度放线菌M1D14菌株发酵液对不同线虫J2的影响

采用梯度稀释法［16]，在灭菌的96孔细胞培养皿中加入50μL不同浓度的M1D14菌株发酵液，以无菌水为阴性对照，5μg／mL阿维菌素和苯线磷为阳性对照，分别向处理和对照中加入50μL浓度为1 000条／mL的线虫，4次重复，放入25℃培养箱中，24h后记录线虫死亡率，计算校正死亡率［17－19]，线虫死活判断采用NaOH刺激法［20]。

下同。

1.2.4.2 不同处理放线菌M1D14发酵液对南方根结线虫J2的影响

在灭菌的96孔细胞培养皿中分别加入50μL经过高温高压灭菌、0.22μm微孔滤膜过滤和未灭菌处理的不同浓度M1D14菌株发酵液，以无菌水为阴性对照，分别向处理和对照中加入50μL浓度为1 000条／mL南方根结线虫J2，4次重复，放入25℃培养箱中，24h后记录线虫死亡率，计算校正死亡率，线虫死活判断采用NaOH刺激法。

1.2.4.3 0.22μm微孔滤膜过滤的 M1D14菌株发酵液对南方根结线虫卵孵化的影响

在灭菌的24孔细胞培养皿中加入100μL 0.22μm微孔滤膜过滤的不同处理浓度的 M1D14菌株发酵液，以无菌水为阴性对照，5μg／mL苯线磷和阿维菌素为阳性对照，分别向处理和对照中加入经过10%NaClO消毒的100μL浓度为2 000个／mL南方根结线虫卵，4次重复，放入25℃培养箱中，10d后记录卵的孵化率［21]。

孵化率＝（线虫孵化数／总卵数）×100%。

1.3 数据分析

所得数据经SPSS17.0软件进行数据处理和方差分析。

2 结果与分析

2.1 放线菌M1D14菌株发酵液对3种线虫活性的影响

从表1结果可见，M1D14菌株发酵液对南方根结线虫、松材线虫和大豆孢囊线虫幼虫均有较好的抑制作用，对南方根结线虫抑制效果最好、其次是松材线虫，对大豆孢囊线虫效果最差。M1D14菌株4倍发酵液对大豆孢囊线虫、南方根结线虫、松材线虫的致死率均可达到100%；稀释16倍后，对南方根结线虫、松材线虫的致死率仍为100%，但对大豆孢囊线虫致死率显著下降，仅为19.67%。菌株发酵液对南方根结线虫的抑制作用明显高于对松材线虫的抑制作用，在稀释36倍后，对南方根结线虫的致死率在80%以上，但对松材线虫的致死率低于10%。

表1 不同浓度发酵液处理24h对3种线虫幼虫的毒力1）

2.2 放线菌M1D14菌株不同处理发酵液对南方根结线虫J2的影响

从表2结果可知，经过高温高压灭菌和0.22μm微孔滤膜过滤的菌株发酵液对南方根结线虫均有较好的抑制作用，在稀释16倍时，高温高压灭菌和微孔滤膜过滤对菌株的活性没有显著影响，但稀释24倍后，微孔滤膜过滤的发酵液活性显著高于高温高压灭菌处理的发酵液活性，显著低于未经灭菌处理的对照组活性。

表2 不同浓度发酵液处理24h对南方根结线虫幼虫的毒力1）

2.3 0.22μm微孔滤膜过滤的放线菌M1D14菌株发酵液对南方根结线虫卵孵化的影响

从表3结果可见，M1D14菌株发酵液不同处理对南方根结线虫卵孵化无明显差异，其作用效果与无菌水相当，略低于苯线磷和阿维菌素，没有表现出对南方根结线虫卵孵化的抑制作用。

2.4 M1D14发酵液与对照药剂阿维菌素和苯线磷杀线活性比较

由表4结果可知，M1D14菌株4倍稀释发酵液对南方根结线虫、松材线虫和大豆孢囊线虫的致死率都为100%；5μg／mL阿维菌素对南方根结线虫致死率达100%，对松材线虫致死率为83.36%，对大豆孢囊线虫致死率为100%；5μg／mL苯线磷对南方根结线虫致死率达100%，对松材线虫致死率为23.6 8%，对大豆孢囊线虫致死率为1 0 0%。M1D14菌株4倍发酵液对3种线虫都有很强的抑制作用，优于5μg／mL阿维菌素或苯线磷的抑制作用。

表3 不同浓度菌株发酵液过滤处理后对南方根结线虫卵孵化的影响

表4 M1D14及对照药剂对3种线虫J2的毒力1）

3 讨论

由于放线菌菌株发酵液活性成分复杂，不同成分对不同线虫的活性位点作用也不尽相同，所以同一菌株的发酵液对不同种类线虫的生物活性存在很大的差异。M1D14菌株经过高温高压灭菌发酵液对南方根结线虫J2活性仍有很大的毒力，说明该菌株发酵液杀线物质耐高温；经过0.22μm微孔滤膜的发酵液对南方根结线虫J2仍有毒力，说明有效成分不是菌体本身，而是其代谢产物。M1D14菌株发酵液对南方根结线虫卵孵化没有抑制作用，但是对南方根结线虫J2具有强毒力，说明M1D14对南方根结线虫的作用机理可能是触杀作用，具体机理尚在进一步的研究中。该菌株不同处理的发酵液与报道的其他生防菌株相比，使用浓度低，节约了生产成本，使其具有很好的应用前景［4]。

菌株发酵液对于3种不同线虫J2的毒力作用与对照药剂苯线磷或阿维菌素作用相当。由于苯线磷为化学药物，对环境有极大的影响，已被列为禁用农药；阿维菌素容易产生耐药性、对于不同线虫作用有差异［22－23]。而该菌株发酵液对3种线虫J2都有很强的抑制作用，与对照药剂相比具有对环境危害小、杀线虫种类多、不易产生耐药性的优势，开发前景广大。

高浓度海洋放线菌M1D14发酵液对3种重要植物寄生线虫都有很强的抑制作用，是一株具有广泛应用前景的生物防治菌株。特别是M1D14发酵液对南方根结线虫具有很强的杀线虫活性，如果应用于生产，将对我国北方地区大棚蔬菜根结线虫的防治产生重大影响。对该菌代谢产物中活性物质的分离纯化及安全性评价正在系统深入研究。

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