FQ-PCR技术在小儿结核性脑膜炎诊断中的应用

刘彦轩，贾安奎，郭盛菊，尚好珍

(1新乡医学院第一附属医院，河南新乡453100;2河南省结核病医院)

结核性脑膜炎(简称结脑)是小儿时期最常见和最严重的肺外结核病之一，病死率高达30% ～50%，幸存者中20% ～50%遗留有永久性神经系统后遗症(如偏瘫、失语、失明等)，早期诊断是决定患儿预后的关键因素［1］。目前临床诊断结脑多依靠实验室检查，但常规实验方法敏感性低、耗时长。陈效友等［2］研究显示，以Taq酶标记的荧光定量PCR(FQ-PCR)检测痰和血标本中结核菌(TB)灵敏度高达10fg DNA和1～5个菌体/mL，灵敏度比普通PCR高10～100倍。2009年3月～2011年2月，我们应用FQ-PCR技术对30例结脑患儿脑脊液中TBDNA进行了检测，并与抗酸杆菌涂片、TB培养、TBAb、腺苷酸脱氨酶(ADA)活性指标进行了比较，旨在为结脑早期诊断提供一个较适宜的实验室诊断方法。

1 资料与方法

1.1 临床资料 同期收治的结脑住院患儿30例(结脑组)，男、女各15例，年龄6个月～12岁(平均5.7 岁)，体质量指数(BMI)为(18.3 ±1.6)kg/m2。均符合胡亚美主编第2002版《实用儿科学》诊断标准，未进行脑脊液检查的结脑患儿［1］排除。另设我院收治的非TB感染性脑膜炎或脑炎患儿为对照组，男、女各15例，年龄5个月 ～12岁(平均5.5岁)，BMI为(19.1 ±1.7)kg/m2;均根据临床表现、脑脊液蛋白增加或葡萄糖量降低，一般抗生素治疗有效或脑脊液中查到特异性病毒抗体IgM，或培养出一般细菌等诊断［3］，其中病毒性脑膜炎18例、化脓性脑膜炎6例、隐球菌脑膜炎3例、脑膜瘤2例、流行性乙型脑炎1例。两组年龄、性别等一般资料具有可比性。

1.2 脑脊液中相关指标检测 ① TB-DNA:采用FQ-PCR法(中山大学达安基因公司产DA7600型扩增仪)。取脑脊液沉淀100μL加入等量浓缩液，振荡数秒，以12 000 r/min离心10 min，弃上清液后加入50μL DNA提取液，置于100℃恒温金属浴10 min。以12 000 r/min离心10 min，取上清液2μL加入毛细管进行PCR反应，每批加有阴、阳性质控品和4个浓度的TB阳性定量参考品，扩增检测步骤按试剂盒操作说明进行，扩增曲线呈s型，且ct值＜30、TB-DNA含量＞5.0×10拷贝/mL为阳性。②抗酸杆菌涂片、TB培养:脑脊液盲法编号后进行沉渣涂片抗酸染色镜检、改良罗氏法培养TB。③TB-Ab 、ADA 活性:应用结明(MyCoDot.TM)结核病快捷诊断试剂盒(美国Dyna-Gen公司)检测TB-Ab，操作参照说明书进行;采用奥林巴斯 OLYMPUS AU2700全自动生化分析仪及北京利德曼ADA测定试剂盒检测ADA活性，按说明书操作(正常参考值0～8 U/L)。上述方法检测阳性标本经抗结核治疗3周后复检。

1.3 统计学方法 采用CS2000统计学软件进行统计学处理。计量数据以¯x±s表示，两样本均数比较采用t或t'检验，两样本率比较采用四格表法Pearson χ2或 Yatesχ2检验，检验水准 α =0.05。

2 结果

2.1 不同指标初检情况 结脑组TB-DNA检测阳性率显著高于抗酸杆菌涂片、TB罗氏培养、TB-Ab(χ2=4.444 4)，但与 ADA 比较无显著差异(χ2=0.266 7)。对照组 ADA有 6例升高，其特异性(80%)低于其他四种指标(100%)，χ2=4.629 6，见表1。

表1 不同指标初检结果比较

2.2 初诊检测阳性标本抗结核治疗3周后复检情况 结脑组16例TB-DNA阳性患者及14例ADA活性阳性患者复检均转阴;对照组6例ADA活性阳性患者复检仍为阳性。

3 讨论

结脑是肺外结核中最具威胁的疾病，早期病死率不足10%，但晚期可达60%以上，故早期诊断意义重大［4］。脑脊液能直接反映中枢神经系统病理变化，是检测的理想标本，其中细菌学病原体检查是实验诊断结脑的“金标准”，但结脑患儿脑脊液中含菌量太低，加之基层医疗机构不规则治疗常致低活力菌和L型菌等细菌生物学性状发生改变［5］，导致细菌涂片、培养敏感性更低，脑脊液常规生化改变不典型，很容易漏诊。本研究显示，抗酸杆菌涂片阳性率为0、TB培养阳性率为6.7%，与文献［6］报道基本一致。此外，TB培养时间约5周，无法满足临床早期诊断结脑的需要。

FQ-PCR是指在PCR反应体系中加入荧光化学基团，通过荧光定量PCR仪实时、自动监测整个PCR扩增过程中荧光信号的积累，检测PCR扩增产物及对未知模板进行定量分析的方法，其TaqMan探针对目标序列特异性高，可用于目标基因的检测和定量，特别适用于单核苷酸多态性(SNP)检测［7］。此外，FQ-PCR全“封闭”式的操作、dUPT-UNG酶防污染体系的设立，在相当程度上解决了普通PCR难以避免的实验污染问题;比普通PCR后的电泳检测灵敏度高2～3个数量级［8］。而传统涂片抗酸杆菌染色法需每毫升痰标本达5 000～10 000条菌以上才可能检出阳性结果［9，10］;改良罗氏培养法的灵敏度可达10条/mL，但一般需要6～8周才能报告结果［10］。

本研究显示，结脑组TB-DNA阳性率明显低于TB-Ab，但对照组两者阳性率均为0。提示此两指标特异性均为100%，但FQ-PCR所测TB-DNA具有更高的敏感性，可降低结脑漏诊率。本研究还显示，结脑组TB-DNA和ADA阳性率相似，但对照组ADA阳性率显著高于结脑组，且6例ADA阳性病例经抗结核治疗后复检ADA结果仍呈阳性。提示此两指标均有较好的敏感性，但ADA特异性偏低，可能造成误诊率增加。

综上所述，FQ-PCR检测脑脊液中TB-DNA较其他传统实验室检测方法更具特异性和敏感性，且操作简便、快速，可作为结脑早期辅助诊断、预后观察和疗效评价的有力手段。

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［10］曹晓慧，张媛媛，万康林.PCR技术在结核病诊断中的应用［J］.中国人兽共患病杂志，2005，21(12):1110-1113.