出血性大肠埃希菌O157∶H7广东分离株对小鼠致病性的研究

谢运冰，顿 灿，王 玉，郭霄峰

(华南农业大学 兽医学院，广东 广州510642)

肠出血性大肠埃希菌Escherichia coli O157∶H7(以下简称 O157∶H7)可引起人的出血性结肠炎(Hemorrhagic colitis，HC)，引发溶血性尿毒综合征(Haemolytic uraemic syndrome，HUS)及血栓性血小板减少紫癜(Thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)等并发症.近年来，O157∶H7引发人的疾病在世界各地包括中国时有暴发流行，对人类健康和环境安全造成巨大威胁，引起各国的广泛关注.动物模型在研究肠出血性大肠埃希菌的毒力因子、发病机理及免疫保护反应方面具有重要作用，对于研究和筛选新疫苗以及评价免疫保护力更是必不可少的.目前报道的动物模型多采用小鼠，也有采用牛、猪或乳兔等，但由于多数实验动物对O157∶H7均不易感，效果大都不理想［1-4］.笔者用萘啶酮酸对离乳小鼠进行处理，提高了小鼠对O157∶H7的易感性，使小鼠出现严重的临床症状甚至死亡并测定出半数致死量(LD50)，为以后对O157∶H7毒力因子的进一步研究奠定了基础.

1 材料与方法

1.1 菌株

O157∶H7 021210(NalR)株［以下简称 021210(NalR)］，由华南农业大学兽医学院微生物教研室谢运冰分离并保存.

1.2 试验动物

普通昆明鼠，20日龄，体质量10～12 g，性别随机.由广东省实验动物中心提供.

1.3 试剂

萘啶酮酸(Nalidixic acid)为Sigma公司产品.

1.4 菌液制备

将021210(NalR)株划线接种于LB固体培养基，挑单菌落，液体LB培养基37℃恒温振荡培养过夜，菌液4 000 r/min离心10 min，弃上清液，以1 mL 8.5 g/L的灭菌生理盐水重悬菌泥.菌液同时作倍比稀释，涂布LB固体培养基，进行菌落计数.

1.5 动物接种

将30只20日龄左右的小鼠随机分为6组，每组5只，腹腔注射前3 d饮水中添加萘啶酮酸(50 μg/mL)，编号并称质量，记录所得数据.腹腔注射021210(NalR)，第1组每只2.5×109个活菌，第2组每只5×108个活菌，第3组每只1×108个活菌，第4组每只2×107个活菌，第5组每只4×106个活菌，第6组为对照组，每只注射生理盐水200 μL.

1.6 观察

记录小鼠体质量并观察其临床症状，统计小鼠死亡数，按寇氏改良法计算LD50，死亡小鼠剖检、进行病理学观察，组织学检查.未死亡小鼠8 d后处死，剖检并进行病理学观察.

2 结果

2.1 临床观察

第1～5组小鼠腹腔注射021210(NalR)1～2 d后体质量骤降，行动迟缓，精神不振，食欲饮欲随注射剂量大小呈不同程度降低，被毛粗乱.第1和第2组小鼠攻毒后1～3 d内陆续死亡，第3组有4只小鼠接种后3～4 d死亡，有1只小鼠5 d后症状减轻，体质量开始逐渐增加.第4组有2只小鼠分别于5～6 d死亡.第5、6组未见临床症状.各组小鼠未出现腹泻症状.各组平均体质量变化见图1.试验结果表明，经萘啶酮酸处理后，021210(NalR)活菌对离乳小鼠的LD50为7.2×107CFU.

图1 离乳小鼠感染不同剂量021210(NalR)后平均体质量变化Fig.1 Average mass changes in weaned mice caused by 021210(NalR)

2.2 病理学观察

将腹腔注射021210(NalR)致死的小鼠剖检后观察发现其肺脏膨大，出现不同程度的淤血、水肿等病理变化;肝脏表面色泽变深，肿大，切面外翻;肾脏眼观无明显变化;腹腔内有黄色恶臭液体渗出，肠粘膜水肿，局部出现充血.取肝脏血液、肾脏血液、腹水、肠积液培养，各组均可获得原021210(NalR)菌株.耐过小鼠和对照组小鼠8 d后剖检未见病变.

2.3 病理组织学观察

发病引起死亡的小鼠肺脏支气管上皮细胞脱落，肺泡壁严重淤血、炎性细胞浸润 (图2A).肝脏轻微淤血，肝细胞脂肪变性(图2B).肾小管上皮细胞变性、肿胀，间质出血;肾小球毛细血管细胞肿胀(图2C).肠管各层结构严重破坏，黏膜坏死脱落(图2D).

图2 各器官病理组织学变化Fig.2 Pathological changes in organs

3 讨论

肠出血性大肠埃希菌O157∶H7可通过食物、水传播，主要致病特点是通过特殊的粘附分子粘附靶器官，产生类志贺毒素(Stx1和Stx2)和肠溶血素(hly)等，感染后引起人的腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合症和血小板减少性紫癫.

国内外的研究表明，成年的 IQI、BALB/c、昆明鼠等对 O157∶H7 均不易感［5-6］.Fujii等［7］使用链霉素处理的小鼠，在接种O157∶H7同时注射丝裂霉素，能导致急性致死性脑病，通常在4 d内死亡.陈亢川等［8］以O157∶H7经腹腔注射感染小鼠，出现了临床症状及死亡.孙洋等［9］使用丝裂霉素和萘啶酮酸处理的离乳小鼠，经口服途径感染O157∶H7，出现了主要病理变化和部分临床症状.但这些试验均未摸索出O157∶H7的半数致死量，为后续的研究带来了不便.

本试验在小鼠饮水中加入萘啶酮酸(50 μg/mL).萘啶酮酸抑制了小鼠体内的正常菌群，增强了021210(NalR)株对小鼠的易感性.经过腹腔注射活菌的小鼠1～5 d内发病、死亡，未出现腹泻症状.O157∶H7感染人引起的组织病理学变化为肠道的出血、水肿，本试验以20日龄昆明鼠为动物模型复制出了这种变化，且病变严重，肠管各层结构严重破坏，黏膜坏死脱落.021210(NalR)株感染小鼠肺脏的病变明显，组织病理变化包括支气管上皮细胞脱落，肺泡壁严重淤血、炎性细胞浸润，肺泡壁严重淤血，其原因可能是小鼠肺脏有更多的Stx受体——球丙糖酰基鞘氨醇.人肾脏组织病理学变化包括肾小球内皮细胞肿胀和血小板及纤维素在肾小球的沉积［10］.本试验证明021210(NalR)株能够引起小鼠肾脏肾小管上皮细胞变性，间质出血，肾小球毛细血管细胞肿胀等实质细胞的损伤.肝脏淤血，肝细胞脂肪变性.本试验详细记录了小鼠从接菌到死亡或恢复期间的体质量变化过程，及其间小鼠的行为变化，并且测算出在该动物模型中021210(NalR)株的LD50.LD50的测定使021210(NalR)株与其他不同菌株或疫苗候选株的比较有了一个准确的剂量参照，为以后的进一步研究做好了铺垫.

试验表明，离乳昆明小鼠通过萘啶酮酸的作用，对O157∶H7感染的敏感性有一定提高，并由此测定出了小鼠的LD50，感染O157∶H7的小鼠出现了大量的组织病理学变化.LD50的测定和该动物模型的建立为进一步研究肠出血性大肠埃希菌O157∶H7的致病性、主要毒力因子的作用奠定了基础.

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