高效液相色谱法测定红霉素肠溶胶囊的含量

伍 蓉，刘融融，万 莉

红霉素肠溶胶囊为大环内酯类抗生素，作为治疗对青霉素过敏感染患者的替代用药。该制剂原质量标准[1]为抗生素微生物检定法，此方法烦琐费时、影响因素多。笔者采用高效液相色谱(HPLC)法测定红霉素肠溶胶囊中红霉素的含量，简便快速，准确可靠，为该制剂的质量控制提供了新的测定方法，现报道如下。

1 仪器与试药

岛津公司LC－20A型高效液相色谱仪(LC－20AT泵，SIL－20A自动进样器，CTO－20A柱温箱，SPD－20A紫外检测器);赛多利斯公司 CP224S型电子天平(最大值210 g;d=0.1 mg)，ME235S型电子天平(最大值210 g;d=0.01 mg)。红霉素对照品(中国药品生物制品检定所，批号为130307－200716，含量为93.5%);红霉素肠溶胶囊(天圣制药集团股份有限公司，批号分别为 101104，101223，110101，110305，110517，规格为 0.25 g);甲醇、乙腈为色谱纯;水为重蒸馏水;其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Diamonsil C18柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:0.067 mol/L磷酸二氢铵溶液(用三乙胺调pH值至6.5)－乙腈(58 ∶42);流速:1.0 mL/min;检测波长:210 nm;柱温:30 ℃;进样量:20μL。按外标法以峰面积计算。

2.2 溶液制备

精密称取红霉素对照品40 mg，至10 mL量瓶中，加甲醇1 mL使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取本品20粒的内容物，研细，混匀，精密称取适量(约相当于红霉素100 mg)，置25 mL量瓶中，加甲醇2.5 mL使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。按处方比例，取除红霉素外的其他组分制得阴性样品，按供试品溶液方法制成阴性对照品溶液。取甲醇1 mL至10 mL量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，作为空白溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验:分别取对照品溶液、供试品溶液、空白溶液和阴性对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，按拟订的色谱条件测定，记录色谱图，结果见图1。可见，溶剂及其他成分对红霉素的测定无干扰，红霉素峰的保留时间约为6 min，能达到基线分离，分离度符合要求，理论板数大于2 000。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察:精密吸取2.2项下的对照品溶液5，10，15，20，25，30，35μL，注入液相色谱仪，按拟订的色谱条件测定红霉素峰面积，以红霉素进样量(X)为纵坐标、峰面积(Y)为横坐标进行线性回归，得回归方程 Y=2.93×104+1.33×105X，r=0.999 9(n=7)。结果表明，红霉素质量浓度在20～140 g/L范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验:精密量取对照品溶液20μL，重复进样6次，按拟订的色谱条件测定。结果峰面积的 RSD=0.35%(n=6)，表明方法精密度良好。

重复性试验:取同一批样品(批号为110101)6份，依法制备供试品溶液，并按拟订的色谱条件测定。结果红霉素的平均含量(标示百分含量)为 101.37% ，结果的 RSD 为 0.68%(n=6)，表明方法重复性良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液 20 μL，分别于 0，2，4，6，8，10，24 h时进样测定。结果的 RSD=0.87%(n=7)，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

加样回收试验:精密称取已知含量的供试品6份(每份约相当于红霉素50 mg)至25 mL量瓶中，加甲醇2.5 mL使溶解，分别精密加入质量浓度为 4 g/L 的对照品溶液 10.0，10.0，12.5，12.5，15.0，15.0 mL，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液按拟订的色谱条件测定，计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果(n=6)

2.4 样品含量测定

取5批样品，按2.2项下的方法制备供试品溶液，精密量取20μL，按拟订的色谱条件测定。结果见表2。

表2 微生物检定法和HPLC法检测结果比较(n=5)

2.5 微生物检定法和HPLC法的比较

比较了5个批号样品的微生物检定法和HPLC法检测结果，见表2。两者测得标示量比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，表明本法可替代微生物检定法对红霉素肠溶胶囊的含量进行控制。

3 讨论

在检测波长选择上，取对照品溶液和供试品溶液分别按拟订的色谱条件在安捷伦1260液相色谱仪(二极管阵列检测器)上测定，记录0～10 min，200～400 nm波长范围内的等吸收图和3D图，发现对照品溶液和供试品溶液的光谱图基本一致，红霉素虽在280 nm波长处有最大吸收峰，但吸光强度较弱;而210 nm波长虽不是最大吸收波长，但该处吸光强度较高，辅料杂质干扰较小。试用210 nm测定，取得了满意的线性关系，且有较好的重现性和精密度。故选用该波长作为检测波长。

首先选择乙腈－水为流动相。因样品的极性较大，选磷酸盐作为流动相成分之一，在进行多次试验后，最终选用0.067 mol/L磷酸二氢铵溶液(用三乙胺调pH至6.5)－乙腈(58∶42)作为流动相，可取得较好的峰形和分离度。

红霉素的高效液相色谱法比微生物检定法简便、准确、灵敏度高、重现性好，为红霉素肠溶胶囊的质量控制提供了依据。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:302.