4种植物提取物对茶炭疽病菌的体外抑制作用

张 亮， 袁 争， 朱 蔚， 高旭晖

（农业部茶叶生物化学与生物技术重点实验室，合肥 230036）

茶炭疽病是常见的茶树叶部病害之一，在我国各产茶区均有发生，山区茶园尤为普遍，除茶树外，还危害山茶、油茶等植物［1]。茶炭疽病主要危害当年生成叶，大流行时可致茶树树势衰落，大量落叶，产量降低［2]。生产上人们往往使用见效快的化学农药来防治此病，但由于长期施用化学农药导致的农药残留问题、抗药性问题愈加突出，与当下大力倡导的有机茶生产形势相悖。生物农药的活性成分是自然界存在的物质，有顺畅的降解途径，这些成分易分解、安全间隔期短，对作物不产生药害［3]，生物农药在茶树病虫防治方面已有了应用，如茶树内生菌对茶树病害的控制作用［4]，而植物源药剂尚无报道。本文研究了4种植物的丙酮提取物对茶炭疽病菌的抑制作用，旨在为茶树病害的无公害防治开辟新的途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试植物及溶剂

侧柏（Platycladus orientalis）叶、香樟（Cinnamomum camphora）叶、艾蒿（Artemisia argyi）（均采自安徽农业大学校内）、芦柑（Citrus madurensis）（周谷堆农贸市场购买）；丙酮（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

1.1.2 供试培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）；水琼脂培养基。

1.1.3 供试病原菌

从安徽农业大学教学科研示范基地采取茶炭疽病叶，分离，经显微观察鉴定证实为茶炭疽病菌，单孢分离纯培养获得。

1.2 试验方法

1.2.1 提取物的制备

将侧柏叶、香樟叶、芦柑皮、艾蒿茎叶洗净，置于恒温箱中50℃烘干至恒重，中药粉碎机粉碎（50～200目），密封保存。分别称取适量各干粉于丙酮中，在40℃恒温气浴振荡器中提取5h后经抽滤获得提取液。采用旋转浓缩的方法将提取液浓缩至膏状，真空干燥以除去残余的丙酮，称重，用丙酮定容，获得相应浓度的提取物。

1.2.2 对炭疽菌菌丝生长的抑制

采用菌丝生长速率法［5]测定不同浓度的提取物的抑菌活性。将各提取物分别配成15 000、10 000、7 500、5 000、1 000μg／mL的浓度，在无菌条件下，向50mL已灭菌的烧杯中加入3mL各浓度的提取物，再加入27mL融化了的冷却至50℃左右的PDA培养基，充分摇匀后倒入培养皿中制成平板，每板10mL，3次重复。此时的浓度为原浓度的1／10。以等量的丙酮和培养基作对照。参照江茂生的方法［6]，将培养基放置在通风橱中3d，以挥发去除溶剂丙酮，接入长势一致的6mm菌饼，于25℃培养箱中培养。定时观察菌丝生长情况，分别在48、72、96、120h用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率。用DPS软件进行差异显著性分析。采用96h的菌丝生长抑制率作为计算有效中浓度EC50的数据。以浓度对数为自变量（x），以抑制率几率值为因变量（y）计算提取物的毒力回归曲线和EC50。

1.2.3 对分生孢子萌发的抑制

采用水琼脂培养法［5]测定提取物对孢子萌发的抑制作用。选取培养7d菌株的PDA平板，在平板中加入适量无菌水，晃动，过滤，即获得孢子悬浮液。将孢子悬浮液配成1×105个／mL的浓度。提取物的浓度配制及平板的制作程序与1.2.2方法相同。将孢子悬浮液滴入处理好的含提取物的水琼脂平板中，并在培养皿背面画圈标记滴入点位置以便观察，每板3点，每点20μL，即3次重复。将各处理置于25℃培养箱中培养，待对照组90%以上萌发时观察并计算孢子萌发率。观察前，先将各处理放入4℃冰箱中，以阻止孢子继续萌发。显微镜观察孢子萌发情况，以每视野下能观察到的80～100个孢子为记录对象。

2 结果与分析

2.1 对菌丝生长的抑制作用

结果表明：1 500μg／mL浓度下，各提取物对菌丝的生长都有较好的抑制作用。其中芦柑皮提取物的抑制效果最好，48h抑制率达100%，余者依次是艾蒿、香樟叶和侧柏叶。各提取物抑制率随着时间的延长有下降的趋势。芦柑皮、艾蒿、香樟叶和侧柏叶96h的抑制率分别为93.32%、61.10%、55.64%和48.20%（表1，图1）。

表1 1 500μg／mL浓度提取物对茶树炭疽病菌菌丝的抑制作用1）

图1 1 500μg／mL不同植物提取物对茶树炭疽病菌菌丝96h抑制效果

通过对菌丝形态观察，1 500μg／mL浓度的芦柑皮、艾蒿处理的菌株48、72h皆出现大量气生菌丝。芦柑皮1 500μg／mL浓度处理的菌株，菌丝48h未能扩展，完全被抑制，之后扩展的菌落边缘不圆整，略呈锯齿状，且各浓度都出现不圆整状况，120h时100μg／mL浓度的得以恢复，高浓度的尚未能恢复，艾蒿、香樟叶和侧柏叶均不见此种状况。

通过Excel软件计算了提取物的毒力回归曲线及EC50（表2）。芦柑皮、艾蒿、香樟叶和侧柏叶各提取物的EC50分别为8.981、839.575、1 058.682μg／mL 和1 429.094μg／mL。侧柏的毒力曲线斜率最大，说明在所设的浓度梯度范围内，浓度的变化对菌丝的影响最大。芦柑皮的斜率最小，香樟叶与艾蒿的斜率相当。

表2 植物提取物对茶炭疽病菌菌丝生长的抑制作用

2.2 对分生孢子萌发的抑制作用

1 500μg／mL浓度芦柑皮、艾蒿、香樟叶和侧柏叶对孢子萌发的抑制率分别为34.85%、85.54%、55.40%和59.68%（图2）。除芦柑皮外，其余提取物均表现出较好的抑制萌发作用。提取物毒力曲线及EC50如表3所示。芦柑皮、艾蒿、香樟叶和侧柏叶对孢子萌发的 EC50分别为5 764.142、281.121、1 502.49μg／mL和969.369μg／mL。

图2 植物提取物对茶炭疽病菌分生孢子萌发的抑制率

表3 植物提取物对茶炭疽病菌分生孢子萌发的抑制作用

3 结论与讨论

4种植物的丙酮提取物对茶炭疽病菌菌丝均有很好的抑制作用，其中芦柑皮抑菌效果显著。艾蒿对菌丝抑制效果相对香樟叶和侧柏叶虽无显著差异，但对孢子萌发的抑制显著。江茂生等2007年报道艾蒿乙醇提取物对多种病原菌有较好的抑制作用［6]，可见艾蒿的抑菌作用具有一定的广谱性。芦柑皮对茶炭疽病菌丝生长的抑制作用显著，而对孢子萌发的抑制率远远低于另外3种提取物，这可能是因为其中的活性物质抑菌机理不同。文献鲜有对芦柑皮防治植物病原菌的报道，肖琳等2010年报道柚皮乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部分对苹果腐烂病菌、辣椒炭疽菌和棉花枯萎菌等植物病原菌有较高的抑制作用［7]，并将其活性成分推测为黄酮类化合物。芦柑皮丙酮提取物对菌丝的EC50达8.981μg／mL，其EC50更是优于肖琳等对柚皮的报道，这可能也是与芦柑皮中富含黄酮类化合物［8]有关，因为黄酮类化合物具有广谱的抗菌作用［9]。本试验中芦柑皮毒力曲线的线性不好，可能是提取物成分复杂，活性成分多样化，芦柑皮中的黄酮类化合物和其他活性成分协同作用造成的，其抑菌活性成分还需分离纯化逐一探明。进一步研究芦柑皮、艾蒿丙酮提取物中的活性物质对于植物源杀菌剂的开发具有潜在的应用前景。

［1]谭济才，叶恭银，高旭晖，等.茶树病虫防治学［M].北京：中国农业出版社，2002：227－229.

［2]谢宝林.茶炭疽病的识别与防治［J].农技服务，2007，24（2）：63.

［3]张志祥，程东美，徐汉虹.生物农药的发展优势及存在问题［J].世界农药，2004（4）：5－10.

［4]陈百文，刘伟，赵恬欢，等.对茶树炭疽病菌具拮抗作用的茶树内生细菌的筛选［J].福建农林大学学报（自然科学版），2010，39（4）：341－346.

［5]方中达.植病研究方法［M].北京：中国农业出版社，1999.

［6]江茂生，许文耀.艾蒿提取物对13种植物病原菌物的抑制作用［J].福建农林大学学报（自然科学版），2007，36（4）：352－356.

［7]肖琳，金玉兰.柚皮提取物对植物病原真菌的抑菌活性测定［J].青岛农业大学学报（自然科学版），2010，27（2）：172－175.

［8]焦士蓉，王玲，林玲.芦柑皮黄酮类物质的微波辅助提取及其抗氧化活性研究［J].西华大学学报（自然科学版），2007，26（4）：36－38.

［9]李叶，唐浩国，刘建学.黄酮类化合物的抑菌作用的研究进展［J].农产品加工（学刊），2008（12）：53－55.