电针对去卵巢大鼠学习记忆能力及海马神经元型一氧化氮合酶mRNA表达的影响

唐 曦 唐成林 刘仁建

（重庆医科大学中医药学院，重庆 400016）

一氧化氮（NO）在神经元的发育，学习和记忆以及与年龄相关的记忆变化中发挥关键的作用［1］。绝经后妇女应用雌激素替代疗法可以增加血浆硝酸盐/亚硝酸盐的含量，这也是NO水平的间接指标［2］，雌激素还可增加脑组织神经元型一氧化氮合酶（nNOS）活性和nNOS mRNA 的表达［3］。但 NO本身的直接精确测量是复杂的，因为其不稳定的性质和极短的衰变时间［4］。在神经细胞中，NO主要由神经元型一氧化氮合酶（nNOS）产生［5］，故常用nNOS的检测间接反映NO合成情况。然而，传统的雌激素治疗由于增加患乳腺癌和子宫癌的风险仍然存在重大的缺陷，因此找到新的治疗策略是有必要的［6］。在临床上，电针对治疗老年妇女认知功能障碍有一定的疗效，但其作用机制尚不清楚。本实验采用卵巢切除大鼠模型，造成低雌激素记忆障碍，观察电针对去卵巢大鼠血清雌激素水平及海马神经元型一氧化氮合酶（nNOS）基因表达的影响，探讨电针改善绝经后妇女认知功能的机制，以期为临床相关疾病的治疗提供科学依据。

材料和方法

1.实验动物分组、模型制备

健康雌性SD大鼠40只，3月龄，体重160－200g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号：SCXK（泸）2007－0005。采用随机数字法将大鼠随机分成4组，每组10只：（1）假手术组；（2）模型组；（3）电针组；（4）假电针组。10%水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司）按0.3ml/100g，腹腔注射麻醉。假手术组切除卵巢周围脂肪，其余各组均实行双侧卵巢切除术。（1）（2）组术后不予任何处理；（3）组切除卵巢2周后予电针刺激，选穴方法按华兴邦氏的方法实施，选取“足三里”“肾俞”两穴，在不麻醉的状态下采用一次性细美容针刺入穴位，双侧足三里穴接通韩氏电针仪（南京济生医疗科技有限公司），刺激参数：连续脉冲波，频率3－4Hz，强度4－5mA，以使大鼠后肢抖动为宜，在上午9时开始，每次20min，隔日1次，连续治疗3个月；（4）组针刺操作同（3）组，但不接通电针仪。水迷宫测试结束后，将大鼠麻醉，颈总动脉取血，分离血清。然后在冰面上断头取脑，并迅速分离海马组织，立即将海马组织置液氮中，于－80℃低温冰箱保存，用于组织RNA的提取。

2.Morris水迷宫测试

于造模前后、治疗后进行测试。

2.1 定位航行试验：历时4d，每天上下午各2次，将大鼠面向池壁，分别从4个入水点放入池中，记录大鼠寻找到并爬上平台所需时间即为逃避潜伏期时间。

2.2 空间探索试验：定位航行试验后去除平台，将大鼠任选一个入水点将大鼠放入池中，测定其在120s内跨越平台位置的次数。

3.酶联免疫吸附分析（ELISA）

从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，空白孔加标本或标准品稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度标准品（100μl/孔），用封板胶纸封住反应孔，36℃温箱孵育90min。提前20min准备生物素化抗体工作液（Estradiol Monoclonal Antibody（4S24（BGN/06/8824）），1.0mg/ml，Thermo Scientific Pierce，USA），洗板5次。空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液（100μl/孔）。用新封板胶纸封住反应孔，36℃温箱孵育60min。提前20min准备酶结合物工作液。空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液（100μl/孔）。用新封板胶纸封住反应孔，36℃温箱，避光孵育30min。加入显色底物100μl/孔，36℃温箱，避光孵育15min。加入终止液100μl/孔，混匀后即刻测量450nm OD值（3min内）。

4.实时荧光定量PCR检测

取100mg海马组织，用Trizol法提取海马组织总RNA，紫外分析及电泳检测总RNA的纯度、浓度及完整性。所提取RNA经分光光度计检测，其A260/280比值均在1.7－1.9，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，28S，18S条带清晰可见，无降解（见图1）。逆转录按ReverTra Ace－α－逆转录试剂盒操作步骤进行，反应条件：42℃30min进行反转录反应，80℃5min进行反转录酶的失活反应，反转录产物－20℃保存备用。引物设计：目的基因及actin的基因序列通过基因库获得，用Primer5设计引物，由Invitrogen Biotechnology Co，LTD中国公司合成。

引物名称 引物序列（5＇－3＇） 片段长度（bp） 退火温度（℃）R－actin－S CGTTGACATCCGTAAAGACCTC 110 58 R－actin－A TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT R－nNOS－S GAGAGGATTCTGAAGATGAGGG 155 58 R－nNOS－A TTGCTAATGAGGGAGTTGTTC

实时定量RT－PCR反应按THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix试剂盒操作步骤进行，PCR扩增反应条件：预变性95℃，1min；PCR反应；循环（40次）95℃，15s→58℃，20s→72℃，20s；末段延伸72℃，5min；溶解曲线72℃→95℃，每20s升温1℃。结果处理采用ΔΔCT法：A＝CT（目的基因，待测样本）－CT（内标基因，待测样本），B＝CT（目的基因，对照样本）－CT（内标基因，对照样本），K＝A－B，表达倍数＝2－K。

5.统计学处理

采用SPSS19.0进行统计学分析，计量资料用均数加减标准差（±s）表示，组间比较用单因素方差分析，组内比较用配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.Morris水迷宫法行为学检测结果

造模前，各组潜伏期时间及跨越平台次数无显著差异（P＞0.05），说明造模前大鼠的认知条件相同；造模后，模型组、假电针组、电针组与造模前比较，大鼠潜伏期时间明显延长，跨越平台次数明显减少（P＜0.01），说明大鼠去卵巢后大鼠学习记忆能力减低；治疗后，电针组大鼠潜伏期时间明显缩短，跨越平台次数明显增加，与治疗前有显著差异（P＜0.01），且显著优于模型组（P＜0.01），并与假手术组无显著性差异（P＞0.05）。说明电针能够提高去卵巢大鼠空间学习记忆能力，逆转记忆损伤。见表1、2。

表1 各组大鼠Morris水迷宫潜伏期测试成绩比较（±s，秒）Table1 Effect of electroacupuncture on latency of each group of rats in morris water maze（±s，sec）

表1 各组大鼠Morris水迷宫潜伏期测试成绩比较（±s，秒）Table1 Effect of electroacupuncture on latency of each group of rats in morris water maze（±s，sec）

＊P＜0.01after operation compared with before operation，＃P＜0.01after treatment compared with after operation，＋P＜0.01 compared with sham group，▲P＜0.01compared with model group，△P＜0.01compared with sham EA group

groups n before operation after operation after treatment sham 10 18.20±4.35 16.04±3.53 18.08±4.28 model 10 18.29±3.21 43.35±4.61＊＋ 42.95±4.05＋sham EA 10 19.35±4.74 45.33±5.85＊＋ 33.61±5.62＋＃▲EA 10 19.02±4.78 45.45±5.65＊＋ 19.02±4.79＃▲△

表2 电针对各组大鼠Morris水迷宫跨越平台数的影响（±s，次）Table2 Effect of electroacupuncture on the number of acrossing platforms in each group of rats in morris water maze（±s，time）

表2 电针对各组大鼠Morris水迷宫跨越平台数的影响（±s，次）Table2 Effect of electroacupuncture on the number of acrossing platforms in each group of rats in morris water maze（±s，time）

＊P＜0.01after operation compared with before operation，＃P＜0.01，＃P＜0.05after treatment compared with after operation，＋P＜0.01compared with sham group，▲P＜0.01compared with model group，△P＜0.01compared with sham EA group

groups n before operation after operation after treatment sham 10 8.69±0.85 8.55±0.99 8.94±0.91 model 10 8.42±0.97 2.56±0.65＊＋ 2.35±0.44＋sham EA 10 8.44±0.85 2.63±0.83＊＋ 3.64±0.88＋＃▲EA 10 8.73±0.79 2.46±0.89＊＋ 8.53±0.83＃▲△

2.电针对去卵巢大鼠血清E2的影响

治疗后3个月，模型组大鼠血清E2水平较假手术组显著下降（P＜0.01），电针组血清E2水平较模型组明显上升（P＜0.01），但仍未达到假手术组水平（P＜0.01），假电针组虽血清E2水平较模型组有所上升，但仍与假手术组、电针组之间有显著性差异（P＜0.01）。结果表明电针能够提高血清E2的水平。见表3。

表3 各组大鼠血清E2浓度比较（±s）Table3 Effect of electroacupuncture on the concentration of serum E2in each group of rats（±s，ng/l）

表3 各组大鼠血清E2浓度比较（±s）Table3 Effect of electroacupuncture on the concentration of serum E2in each group of rats（±s，ng/l）

＋P＜0.01compared with sham group，▲P＜0.01compared with model group，△P＜0.01compared with sham EA group

group n serum E2concentration（pg/ml）sham 10 65.13±7.72 model 10 38.16±5.44＋sham EA 10 49.29±5.90＋▲EA 10 56.47±6.70＋▲△

3.电针对去卵巢大鼠海马nNOS mRNA的影响

与假手术组比较，模型组大鼠海马nNOS mRNA表达显著降低（P＜0.01），与模型组比较，电针组和假电针组nNOS mRNA表达均有显著升高，电针组改变更明显（P＜0.01），但仍未达到假手术组水平（P＜0.01）。结果表明电针能够上调去卵巢大鼠海马nNOS mRNA表达。见图1。

图1 A：电泳检测mRNA电泳结果B：各组大鼠海马nNOS mRNA相对表达量比较（±s）Fig.1 AElectrophoresis mRNA electrophoresis B Effect of electroacupuncture on nNos mRNA expression in hippocampus of each group of rats（±s）

讨 论

一氧化氮（NO），一种大脑新的神经元信使，通常作为一种神经递质样分子，容易横跨细胞膜进行扩散，从而被认为在神经系统发挥广泛的功能。NO是一种细胞间的信使，已经有大量研究表明其在学习和记忆进程中发挥关键作用，因此被看作是学习和记忆的关键调解者。谷氨酸作用于突触后N－甲基－天门冬氨酸（NMDA）及非NMDA受体，Ca2＋内流进入突触后与钙调蛋白（CaM）一起激活NOS，诱发产生NO。经典的途径为NO作用于靶受体可溶性鸟苷酸环化酶进而增加细胞内的环鸟苷酸（cGMP）水平，随后由cGMP依赖的蛋白发生磷酸化级联反应。NO能扩散至神经细胞激活邻近细胞的鸟苷酸环化酶，并作为一种信使分子调节哺乳动物大脑神经生理活动行为，如长时程增强（LTP），并已公认通过调整神经递质和神经肽的释放，增加海马神经元的神经递质从突触前末梢的释放，激活突触前和改变突触活动调节神经递质的分泌，从而对行为和认知有调节作用［7］。NO作为逆行信使参与N－甲基－D－天冬氨酸（NMDA）受体介导的长时程增强（LTP），这被认为是一种记忆的突触模型。数量惊人的证据表明NO作为逆行信使，参与海马突触可塑性，促进海马顺行和逆行突触信号和突触传输，参与诱导并完成LTP，从而影响学习和记忆［3］。NO影响记忆的获得，这个过程被认为与LTP诱导期相关。长时程增强（LTP）认为是学习与记忆的神经基础，是突触可塑性的功能指标之一。NO供体在海马树突状颗粒细胞的释放选择性增加体内树突微管相关蛋白基因。Hindley［8］等报道NO供体治疗的小鼠海马细胞培养与对照组比较表现出更长、更多的神经突起和更高比例的突起神经元细胞。这些作者也提供证据表明通过NO激活鸟苷酸环化酶增强神经生长因子诱导的PC12培养细胞的突起生长，并伴随着cGMP产生的增加，总之，一些证据证明：NO促进大脑海马突触发生。值得我们关注的是：NO还具有胆碱能传递的调节作用：L－精氨酸和NO供体减少抑制性突触的乙酰胆碱（Ach）释放而增加兴奋性突触Ach释放，nNOS抑制剂则有相反的影响［9］。NO还可能调节钙非依赖性方式的神经递质释放和传输，空间信号，各组神经元和神经胶质的非突触传导，谷氨酸刺激产生的NO诱导附近神经元谷氨酸和多巴胺的胞吐和释放，从而影响突触可塑性［10］。除了调节释放，NO还抑制神经递质的再摄取，特别是有关谷氨酸和多巴胺系统。增强神经递质的释放和抑制再摄取这两种影响可以增加神经递质在突触间隙的可用性，这又可能会影响突触后受体的调制从而在学习和记忆过程中发挥作用。

NO是一个性质不稳定的“气体型”小分子，可自由通过细胞膜，通过氧化还原反应发挥其生物学功能。NO合成后没有专门的贮存机制，也没有专门的受体，生成后就向四周扩散并直接透过细胞膜而作用于邻近细胞，其性质活泼，半衰期极短，在体内生物半衰期仅数秒钟，因而目前尚难以对其进行直接测定，而NOS是NO合成过程中的关键酶，其活性可间接反映NO的代谢状况［4］。所以研究NOS在脑内的表达，可为进一步弄清NO在脑内的生理功能提供分子生物学依据。NO主要有三种类型：神经元型（nNOS）、诱导型（iNOS）和内皮细胞型（eNOS），所有类型的NOS在神经系统内均存在，但对nNOS的研究更频繁［11］。nNOS在正常状态下表达的活性依赖Ca2＋及钙调蛋白（CaM），并以少量突发形式产生NO，发挥其分子信使等生理功能。nNOS作为逆行信使参与LTP，这个过程在记忆形成中起着关键作用。Phung［12］等发现神经生长因子需要nNOS的存在才能刺激PC12分化。此外，已经发现在逃避学习或接触空间新事物时，NOS免疫反应性在海马大大增强［13］。这些发现表明记忆获得可能需要上调NOS活性。

Holscher［14］等应用 nNOS抑制剂7－硝基吲唑（7－NI）显示出受损的空间学习记忆，并因此确定对nNOS的理解作出了重大贡献。已有研究表明，NOS抑制剂损害SD大鼠的学习记忆，尤其是在较早阶段NOS抑制剂抑制NO神经元产生从而扰乱动物实验的记忆过程，NOS抑制剂如N－硝基－L－精氨酸甲酯（L－NAME）阻碍大鼠海马切片CA1区LTP的诱导，并在动物几个学习测试中造成行为损害［15］。Chapman［16］等 观察大 鼠注射 L－NAME 或L－NARG后，水迷宫测试中表现为失忆症，而L－精氨酸注射能够通过争夺NOS的结合位点阻止LNARG的影响。另外一个重要方面是L－NAME具有与乙酰胆碱受体拮抗的特性，因此阻断乙酰胆碱受体从而造成学习记忆损伤［17］。NO可改善学习和记忆这一观点因为NOS抑制剂损害学习和记忆这一事实而被支持。虽然NOS抑制剂对LTP和记忆形成的影响存在矛盾结果，然而NOS参与海马LTP形成是明确的，这差异是由于学习和记忆任务的形式不同产生的［18］。与药物抑制剂相似，nNOS的基因抑制在Morris水迷宫测试中表现出空间记忆受损［19］Inglis［20］等报告nNOS基因敲除小鼠运动神经元的树突分支显著降低。海马nNOS基因敲除小鼠表现出突触相关蛋白异常表达［21］。nNOS基因阻断导致认知功能障碍，运动神经元树突的发展受损。因此，nNOS基因剔除小鼠在Morris水迷宫测试中受损的空间表现可能是由于海马的突触发生受阻或特定蛋白紊乱，得出任何结论前需要进一步的研究。

已有研究发现雌激素可增加脑组织神经元型一氧化氮合酶（nNOS）活性和nNOS mRNA的表达［21］。Grohe［22］等在雌激素长期治疗的去卵巢雌性大鼠身上已得到证实：雌激素诱导这些大鼠海马nNOS表达。有趣的是，有报告表明利用NOS抑制剂L－NAME可能阻碍去卵巢大鼠MWM评估中雌激素介导的空间学习记忆的恢复［23］，这一结果表明NO和雌激素在特定脑区有相互作用。生化数据显示，nNOS能够与突触后支架分子PSD－95结合，形成一个复杂的NMDA受体复合物，这种影响取决于雌激素［24］。此外，雌性小鼠雌激素分泌高峰期，PSD－95表达增加［25］。免疫印迹研究表明去卵巢雌性大鼠接触到雌激素后nNOS表达亦有变化，实验条件下在雌性大鼠海马中，已被证明雌二醇和nNOS之间存在直接关系［22］。已有报道海马CA1区锥体神经元表现出nNOS免疫反应性，而锥体神经元在海马细胞中占主导地位，在海马CA1和CA3区锥体神经元表达雌激素受体α和β［26］，因此雌激素受体介导的雌激素的作用可能是通过增加NO的生成。雌激素可能通过间接行动影响nNOS，涉及能够调节nNOS启动子的调控因子的干预，例如，雌激素依赖性转录因子AP－2、AP－2能诱导几种基因激活比如雌激素受体，并已发现在小鼠海马存在AP－2表达细胞［27］。活体内雌激素水平的生理变化与nNOS表达调控的关系仍不清楚，但是，极有可能依赖多种因素包括雌激素受体分布和共存，雌激素调节转录因子和信号蛋白。总之，在这项研究报告的数据表明，海马一氧化氮能神经元数量可能会有所不同，这可能取决于生理条件下雌激素的变化。

本实验采用Morris水迷宫测试、ELISA以及实时荧光定量的方法分别检测了去卵巢大鼠行为学、血清雌二醇、nNOS mRNA表达的变化及电针对其的影响。我们采用nNOS的检测确定NO的作用机制证明了其可行性，使用这一参数，我们已经表明NO在大鼠脑海马学习记忆过程中有重要作用。结果显示：Morris水迷宫测试中，模型组大鼠在定位航行实验中潜伏期比假手术组明显延长，在空间探索实验中穿越平台次数比假手术组明显减少。说明去卵巢大鼠的学习记忆能力明显下降。与治疗前相比，治疗后电针组与假电针组潜伏期缩短，穿越平台次数增加，且电针组改变更明显。说明从行为学角度评价，电针可改善去卵巢大鼠的学习记忆能力。我们还观察到模型组大鼠体内雌激素明显减少的同时，海马nNOS mRNA表达水平明显降低，电针组与假电针组雌激素水平上升，其nNOS mRNA表达水平亦明显升高，且电针组改变更明显。说明电针能提高体内雌激素水平，并且nNOS mRNA表达受体内雌激素水平变化的影响，提示老年妇女认知功能的减退与体内雌激素水平和海马nNOS mRNA表达降低有关。这与Funato等［28］报道的雌激素缺乏和雌激素受体的异常，可以影响MCI及AD的发生和发展的观点一致。去卵巢后海马nNOS mRNA表达显著下降，电针治疗逆转了这些不利影响，这与Morris水迷宫测试中行为学改善的结果一致。因此这些数据表明电针对海马nNOS mRNA表达的调整与Morris行为学的改变可能存在因果关系。已被证明nNOS与NMDA受体的联合依赖雌激素介导，从而提高nNOS的活性，雌激素通过激活NMDA受体增加树突棘密度，触发nNOS表达，诱导NO信号激活，这可能有助于学习和记忆［24］。因此电针可能通过提高雌激素水平，上调nNOS mRNA表达，促进NMDA受体诱发海马神经元的活性，调节NO的产生，减少去卵巢引起的学习和记忆损害，这可能是针刺改善老年妇女学习记忆功能的机制之一。这些发现表明NO确实参与学习记忆的过程，有助于进一步明确NO在记忆过程中的作用。我们的研究也对痴呆病nNOS的异常表达提供了一些证据，特别是阿尔茨海默氏病。

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