乙型肝炎病毒外膜大蛋白检测及临床应用

西安交通大学医学院第二附属医院检验科（西安710004）

李妙羡 吴晓康 王香玲 耿 燕 卢 洁 王小利 张 妮 魏雅凤

乙型肝炎病毒（HBV）为嗜肝DNA病毒，含有3200个核苷酸，其中S基因编码合成的HBV外膜蛋由3种蛋白组成，包括主蛋白（即HBsAg），中蛋白（即HBsAg和Pre－S2蛋白）和大蛋白（即 HBsAg、Pre－S1蛋白 和 Pre－S2 蛋 白）［1］。大 蛋 白 存 在 于 感 染 颗 粒（Dane颗粒）和亚病毒管状颗粒上，是病毒形成完整外膜的重要标志，与病毒复制密切相关，对HBV复制过程具有反式激活作用，并与病毒颗粒从细胞内释放有关，乙肝病毒外膜大蛋白（HBV－LP）在肝细胞内质网积聚是导致内质网应激的关键因素，并与肝细胞毒性甚至肝癌相关［2］。近年来随着对HBV外膜蛋白研究的深入，发现其有双重跨膜拓扑结构［3］，这是 HBVLP发挥多功能作用的依赖性结构。通过其在乙型肝炎发病机制、感染与病毒复制等方面的研究，使人们逐渐认识到了其越来越重要的临床意义。笔者检测了238例 HBV－M 阳性血清中 HBV－LP 、HBV－DNA、Pre－S1－A，并进行了分析，探讨其在临床中的应用。

材料和方法

1 材 料 收集2012年1月至2012年3月西安交通大学医学院第二附属医院门诊及住院患者278例，其中 HBV－M 阳性患者血清238例 （HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性65例；HBsAg、HBeAb、HB－cAb阳性116例；HBsAg、HBcAb阳性53例；HB－sAg、HBeAg、4例），男143例，女95例，年龄2～73岁，平均35.3岁；正常对照40例，男18例；女22例，年龄7～63岁，平均40.3岁，GPT、GOP、HBV－M、HBV DNA、HBV－LP及 Pre－S1－Ag均为正常。所有血清标本均于－80℃保存。

2 方 法

2.1 HBV DNA检测：采用实时荧光定量聚合酶链反应技术（PCR）检测，仪器为美国ABI公司7500型扩增仪，试剂盒（YZB／国0371－2009）购自广州中山大学达安基因公司，操作严格按照试剂盒说明书进行。HBV DNA阳性判断标准标准：HBV DNA含量≥103IU／ml为阳性。

2.2 乙型肝炎病毒Pre－S1－Ag检测：采用酶联免疫 （ELISA）技术，试剂 （YZB／国0371－2009）购自上海阿尔法生物技术有限公司，仪器为雷杜6100型酶标仪及3900型洗板机，操作严格按照试剂盒说明书进行。Pre－S1－Ag阳性判断标准：S／CO≥1为阳性。

2.3 HBV－M检测：采用酶联免疫 （ELISA）技术，试剂盒 （YZB／国0371－2009）购自于北京万泰生物技术有限公司，仪器为雷杜6100型酶标仪及3900型洗板机，操作严格按照试剂盒说明书进行。HBV－M阳性判断标准：HBsAg、HBsAb、HBeAg为S／CO≥1为阳性；HBeAb、HBcAb为S／CO≤1为阳性。

2.4 HBV－LP检测：采用酶联免疫 （ELISA）技术，试剂盒 （YZB／国0371－2009）为北京热景生物技术有限公司赠送，仪器为雷杜6100型酶标仪及3900型洗板机，操作严格按照试剂盒说明书进行。HBV－LP阳性判断标准：S／CO≥1为阳性。

以上四种试剂均在有效期内并有试剂盒内、外质控（除 HBV－LP）。

3 统计学方法 采用χ2检验。

结 果

1 HBV DNA与HBV－LP阳性率比较：HBV DNA与HBV－LP阳性率比较，见表1。238例HBVM阳性患者血清同步检测HBV DNA和HBV－LP，结果显示，HBV DNA阳性（＋）174例，阳性率为73.11%（174／238）；HBV－LP阳性（＋）198例，阳性率为83.19%（198／238）。以 HBV DNA 和 HBV－LP为判断病毒复制指标，有显著性差异（P＜0.05）。

表1 HBV DNA与HBV－LP检测结果

2 Pre－S1－Ag与 HBV－LP阳性率比较：Pre－S1－Ag与HBV－LP阳性率比较，见表2。238例 HBV－M阳性患者血清同步检测Pre－S1－Ag和 HBV－LP，结果显示，HBV－LP阳性（＋）198例，阳性率为83.19%（198／238）；Pre－S1－Ag1阳 性 （＋ ）184 例，阳 性 率 为77.31%（184／238）；二者有显著性差异（P＜0.05）。

表2 Pre－S1－Ag与 HBV－LP检测结果

3 HBV标志物不同模式HBV DNA与HBV－LP检出率比较：HBV标志物不同模式HBV DNA与HBV－LP检出率，见表3。238例HBV－M阳性患者血清同步检测HBV标志物、HBV DNA和HBV－LP，结果显示，65例HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性（＋）标本中 HBV DNA，阳性率为95.4%（62／65），HBV－LP阳性率为96.9%（63／65）；116例 HBsAg、HBeAb 、HBcAb阳性（＋）标本中HBV DNA阳性率为67.0%（80／116），HBV－LP阳性率为75.9%（88／116）；4例HBsAg、HBeAg阳性（＋）标本中HBV DNA阳性率为100.0%（4／4），HBV－LP阳性率为100.0%（4／4）；以上三种模式，HBV DNA与HBV－LP的阳性率比较无显著性差异（P﹥0.05）；53例 HBsAg、HBcAb阳性（＋）标本中 HBV DNA 阳性率为52.8%（28／53），HBV－LP阳性率为84.9%（45／53），二者比较有显著性差异（P＜0.05）。

4 正常对照40例，GPT、GOP、HBV－M、HBV DNA、Pre－S1－Ag及 HBV－LP检测均为阴性。

表3 HBV标志物不同模式HBV DNA与HBV－LP检出率比较

讨 论

乙型肝炎具有较强传染性，且病后发生肝硬化、肝癌的相对危险度增高［4］，对患者生活、健康等造成严重影响，因此如何通过实验室检测手段对乙肝的诊断、抗病毒治疗、病情进展情况及病毒复制进行监测评估是该病防治工作的重要一环。目前，常以外周血HBV DNA、HBeAg、Pre－S1－Ag作为临床判断 HBV病毒复制程度的指标，HBV DNA定量检测结果也已成为抗病毒治疗效果和患者预后判断的重要依据。但由于HBV DNA前C区nt1896位和基本核心启动子区（BCP）1762、1764位联合突变导致 HBeAg阴性乙型肝炎、以及由核苷类药物对HBV DNA复制的快速抑制，使患者血清中保留着低水平HBV DNA，加之，在HBV形成包膜的过程中需要大蛋白（即HBsAg、Pre－S1蛋白和Pre－S2蛋白）和中蛋白参与［5］，因此检测Pre－S蛋白的存在对于判断HBV复制具有一定的意义。以往检测是通过检测大蛋白的独有片断Pre－S1蛋白来实现的［6］，但是编码 Pre－S蛋白的 HBV－LP Pre－S区具有较复杂的双重拓扑结构［3］，导致 Pre－S1－Ag的检出率低［7，8］不能很好反映HBV的复制情况。基于以上原因，可能造成假阴性结果，该研究也证明了这一点，近年来国内外关于乙型肝炎病毒包膜蛋白结构的大量研究证明，HBV－LP主要存在于不含核酸的亚病毒颗粒以及完整的乙型肝炎病毒颗粒，且与乙型肝炎病毒的复制有着密切的关系，能在一定程度上反映乙型肝炎病毒复制情况［9］，病毒复制期HBV－LP大量滞留在肝细胞中，对肝细胞有直接的毒性作用，且对HBV复制的过程具有反式激活作用，并与病毒颗粒从细胞内释放调节有关［2］，有研究表明在治疗应答过程中HBV－LP比HBV DNA阴转大约5个月，在不同的个体可能时间不一样［10］，所以 HBV－LP的检测对乙型肝炎的诊断、治疗效果的观察以及是否治疗彻底有非常重要。

本研究我们通过对患者血清中HBV－LP、HBV DNA、HBV－M 及 Pre－S1－Ag进行了检测，结果显示：HBV－LP能够反映HBV的复制情况，血清中HBVLP含量与 HBV DNA、Pre－S1－Ag和 HBeAg有着很好的相关性；且比 HBV DNA、Pre－S1－Ag和 HBeAg能更好的反映HBV复制水平；HBV－LP在 HBV感染的不同模式中：HBsAg、HBeAg、HBcAb；HB－sAg、HBeAb、HBcAb；HBsAg、HBeAg；三种模式，HBV DNA与HBV－LP的阳性率基本一致；HBsAg、HBcAb 模式HBV DNA与HBV－LP检测阳性率差异非常大。说明HBV－LP在HBV感染血清中比HBV DNA、Pre－S1－Ag和 HBeAg更敏感，分析其原因：①血清HBeAg阴性结果不能说明不存在HBV病毒复制时［11，12］，可能与长期抗病毒治疗导致基因变异造成抗原合成障碍有关；②血清HBV DNA阴性同样不是一定表明患者体内的HBV病毒完全清除可能是因为HBV DNA检测的灵敏度有限或水平较低，有研究表明血清HBV DNA水平较低时，肝脏内仍可存在一定量的HBV DNA；③以往检测血清HBV－LP是通过检测其独有片段Pre－S1－Ag来实现，但是编码Pre－S蛋白的 HBV－LP Pre－S区具有较复杂的拓扑结构［3］导致Pre－S1－Ag检出率较低；④HBV－LP（即 HBsAg、Pre－S1蛋白和 Pre－S2蛋白）［1］，涵盖范围广检测阳性率高。HBV患者血清中 HBV－LP的检测，可弥补HBV DNA检测在HBV患者抗病毒治疗终点判断及疗效评估中的不足，当HBV患者血清中HBeAg、HBV DNA、Pre－S1－Ag阴性时，通过检测 HBV－LP可了解体内HBV病毒复制、疾病进展情况及抗病毒疗效与预后，有效阻止病情进一步恶化。在HBV感染者HBV DNA阴性患者的血清中检测HBV－LP阳性，对停药反弹具有很好的临床指导意义。

综上所述，HBV－LP、HBV DNA、HBeAg及Pre－S1－Ag四种标志物，从灵敏度来说，HBV－LP（83.1%）＞Pre－S1－Ag（77.3%）＞ HBV DNA（73.1%）＞HBeAg（54.1%）。笔者认为对 HBV患者，特别是HBeAg和HBV DNA阴性患者，检测血清中HBVLP含量对患者疾病进展情况及抗病毒疗效与预后，阻止病情进一步恶化及对停药反弹评估尤为重要；HBV－LP阴转是否能作为预示抗病毒治疗较为彻底有待于进一步观察。HBV－LP检测操作简单、快速、无需特殊仪器设备，适合各级医院推广应用，尤其对那些无条件开展HBV DNA检测单位，检测HBV－LP就更有意义，如果条件允许同时检测血清中HBV－M、HBV－LP、HBV－DNA 及 Pre－S1－Ag标志物能有效降低单项检测的漏检风险。HBV－LP可作为病毒复制指标同时也是常规检测的一个补充指标。

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