BACTEC MGIT 960在二线抗结核药物药敏试验中应用初探＊

陕西省结核病防治院 （西安710100） 梁亚萍 刘尚武 高 漫

耐药结核病产生的重要原因之一是不规范的抗结核治疗，使结核分枝杆菌感染难以控制。抗结核药物特别是二线抗结核药物的规范化使用，对耐药结核病的防治具有十分重要的意义。早期、准确、快速的抗结核药物敏感性检测试验可以为临床的规范化治疗提供可靠依据。但是，传统的二线药物药敏实验检测方法需时较长，远不能满足临床诊治的需求，因此有必要建立新的结核分枝杆菌快速药敏检测技术。美国BD公司生产的BACTEC MGIT 960主要用于结核杆菌的快速诊断和一线药物的药敏检测，目前，国外一些研究人员已经开始将其用于二线药物药敏检测［1，2］。本研究利用BACTEC MGIT 960进行96例结核菌株二线药物药敏检测，并与传统的L－J比例法进行对比，探讨其在二线药物药敏试验中的应用价值。

材料与方法

1 标本来源 本研究的96例菌株是2009年12月至2010年6月收集本院肺结核住院患者痰标本做快速培养，阳性菌株在完成一线药物的敏感性试验后，选取耐药菌株（不论何种耐药）行二线药物的药物敏感性试验，以H37RV（ATCC27294）作为阴性对照。

2 试 剂

2.1 药物：4种二线药物为卷曲霉素（CPM），氧氟沙星（OFLX），卡那霉素（KAN），乙硫异烟胺（ETH）均为Sigma产品。药物使用时均按照厂家提供的纯度和效价计算用量：ETH和OFLX按照1000 μg／mg计算用量，CPM 按照795μg／mg计算用量，KAN按照762μg／mg计算用量。CPM和KAN用无菌去离子水溶解，OFLX用0.1NNaOH溶解，ETH用乙二醇溶解，各药物在培养基的终浓度，见表1。

表1 含药培养基的终浓度

2.2 BACTEC MGIT 960用试剂：分枝杆菌生长指示管（MGIT），SIRE添加剂，生长添加剂均为BD公司产品。

2.3 L－J方法用试剂：L－J法所用对照和含药培养基均为改良罗氏培养基，其为贝索公司产品。

3 药敏试验 96株结核分枝杆菌临床分离菌株分别用MGIT 960法（以下称960法）和L－J比例法（以下称L－J法）测试其药物敏感性。

3.1 接种与孵育：①960法：二线药物药敏试验方法与SIRE近似：每株结核杆菌需准备5支MGIT960培养管（1管为生长对照管，4管为加药管），每管均加入0.8ml SIRE添加剂，4支加药管各加入100ul CPM，KAN，OFLX，ETH，药物终浓度见表1。然后，每支加药管加入0.5ml菌悬液（报阳当天为第0d，报阳第1～2d的标本直接加原液，3～5d的标本需用1／5无菌生理盐水稀释），生长对照管（GCT）加l／100无菌生理盐水稀释的菌悬液0.5ml。将准备好的MGIT管按GCT，CPM ，OFLX，KAN，ETH的顺序放入AST试管架，系统扫描试管架条形码，按照仪器指示位置放入BACTEC MGIT 960仪器。②L－J法从报阳第4～5d的MGIT管（报阳后需置于37℃培养箱）底部吸取适量菌液于无菌研磨器中研磨，以0.5%吐温－80生理盐水配成1个麦氏比浊浓度，并用生理盐水稀释至10－2mg／ml和10－4mg／ml的菌悬液，取稀释好的菌悬液分别接种于对照和含药培养基，37℃培养。

3.2 结果判定：①960法 MGIT 960仪器会在4～13d内，根据Growth Unit值，自动报告耐药与敏感结果，但所出报告的药物顺序为CPM，OFLX，KAN，ETH。②L－J法：根据耐药百分比判别：耐药百分比＝（含药培养基的菌落数／对照培养基的菌落数）×100%，若耐药百分比＞1%为耐药（R），≤1%为敏感（S）。

4 质量控制 每批试验均应做质控，质控菌株为结核分枝杆菌标准株H37Rv。菌株对所有的抗结核药物均敏感。

5 统计学方法 MGIT 960法和L－J法药敏试验测定结果的比较采用χ2检验，测定时间的比较采用t检验，P＜0.05表明差异有统计学意义。

结 果

1 960法与比例法药敏结果比较：应用960法与L－J法检测96株结核杆菌临床分离菌株的CPM、OFLX、KAN和ETH的药敏结果，见表2。两法检测CPM药敏结果相符94株，不符2株；检测OFLX药敏结果相符96株，不符2株；检测KAN药敏结果相符86株，不符10株；检测ETH药敏结果相符82株，不符14株，符合率别是97.9%、97.9%、89.6%、85.4%。

表2 960法与L－J法检测二线药物的药敏结果

2 960法与比例法的检测时间：960法进行二线药物药敏试验所需的时间平均9.1d，较L－J法32.5d早23.4d，二者的差异有统计学意义（P＜0.01），见表3。

表3 药敏试验测定所需时间（d）

讨 论

近年来，全球耐药结核病的发病率呈上升态势［3］，已严重威胁人类的身体健康。耐药结核病主要是由于滥用抗生素和不规范治疗引起，因此，合理的临床治疗对于控制耐药结核病极为关键。快速、准确的药敏检测不仅是临床选择和评价化疗方案的有效依据，还是重要的流行病学指标，有助于我们掌握耐药结核杆菌的分布和流行趋势，对于控制耐压结核病的流行和传播至关重要。

二线抗结核药是治疗耐药结核病的主要药物，但目前，国内常用的二线药物药敏试验—L－J比例法耗时较长，远不能满足临床早期诊断和治疗的需求，因此，迫切需要开展新的快速、准确二线抗结核药耐药性检测技术，以指导临床合理用药，这对控制耐药结核病的流行和传播至关重要。

MGIT 960是美国BD公司在BACTAC 460基础上不断改进和完善的新一代荧光检测系统，一套分枝杆菌自动快速培养及药敏系统，已获得美国FDA的认证。尽管没有专门的二线药物试剂盒，但其用于二线药物的敏感性诊断也被 WHO认可［3］，我们研究结果也显示：960法的CPM、OFLX、KAN、和ETH的药敏试验结果与L－J比例法有较高的符合率，分别为97.9%，97.9%，86.9%和85.4%。

在检测时间方面，MGIT960法具有很大的优势，平均9.1d就能发出药敏报告，比L－J比例法缩短了23.4d。

MGIT 960法不足之处是需要昂贵的仪器设备，且检测费用较高。

综上所述，MGIT 960所得的二线药物药敏结果与传统比例法有较好的一致性，所需的检测时间较短，若患者经济条件允许，建议选择MGIT 960方法进行二线药物药敏试验，以便能更快速、准确地提供耐药报告。

［1］ Kruuner A，Yates M D，Drobniewski F A.Evaluation of MGIT 960－based antimicrobial testing and determination of critical concentrations of first－and second－line antimicrobial drugs with drug－resistant clinical strains of M.tuberculosis［J］.J Clin Microbiol，2006，44（3）：811－818.

［2］ Rüsch－Gerdes S，Pfyffer G E，Casal M，etal.Multicenter laboratory validation of drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis against classical secondline drugs and newer antimicrobials by Bactec MGIT 960 Technique［J］.J Clin Microbiol，2006，44（3）：688－692.

［3］ Aziz M A，Wright A，Laszlo A，etal.Epidemiology of antituberculosis drug resistance（the Global Project on Anti－Tuberculosis Drug Resistance Surveillance）：an updated analysis ［J］.Lancet，2006，368（9553）：2142－2154.