牛支原体蛋白质组学双向电泳技术的建立及初步分析

陈 维，李 媛，辛九庆，刘 洋，张秀英

（1.东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室，哈尔滨 150001）

牛支原体（Mycoplasma bovis,M.bovis）属于柔膜体纲（Mollicute），支原体目（Mycoplasmatales），支原体科（Mycoplasmataceae），支原体属（Mycoplasma），是牛肺炎、关节炎、乳腺炎和角膜结膜炎等一些其他疾病的主要病原[1-5]。该病原1961年首次在美国牛乳腺炎病例中分离得到[6]。近几年M.bovis相关疾病的广泛传播给世界养牛业造成严重的经济损失[7]。我国于2008年首次从呼吸道疾病病例中分离得到M.bovis病原[2]。试验通过对M.bovis全菌蛋白样品的制备，固相干胶条pH梯度等双向电泳的几个关键环节进行分析，建立了适合分离M.bovis蛋白的双向凝胶电泳技术方案，得到了分辨率较高和重复性较好的电泳图谱，并对部分蛋白进行质谱鉴定，初步分析其功能，为进一步对M.bovis进行蛋白质组学研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

M.bovis Hubei分离株由哈尔滨兽医研究所细菌室支原体研究组从湖北省送检的牛肺中分离纯化及保存[2]。

1.1.2 主要试剂和设备

IPG干胶条13 cm（pH 4～7和 pH 3～10）、IPG Buffer（pH 4～7和 pH 3～10）、CHAPS、二硫苏糖醇（DTT）、尿素、硫脲、碘乙酰胺（IAA）、2D quant试剂盒，2D Clean-up试剂盒，考马斯亮蓝R350均购自美国GE healthcare公司。快速银染试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

等电聚焦系统Ettan IPGphorⅢ，胶条槽Ettan IPGphor Manifold，标准垂直电泳系统SE 600 Ruby，扫描仪Image Scanner美国安玛西亚公司，超速离心机美国Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 样品的处理

将M.bovis菌株接种于含100 mL·L-1马血清的马丁肉汤培养基中，37℃培养至浓度（CFU）为1×108～1×109个·mL-1时，取培养物14 000 r·min-1离心1 h收集菌体沉淀。将菌体沉淀洗涤3次（洗涤缓冲液：10 mmol·L-1Tris-Cl）。……