Balb/c小鼠花生过敏模型的建立及发病机理

刘志刚，杨成彬，2，闫 浩，2，刘晓宇，2，夏立新，李 荔，2

1)深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所，深圳518060;2)深圳大学生命科学学院，深圳518060

食物过敏反应是一种速发型变态反应，由过敏原特异性IgE抗体介导，当其作用于肥大细胞时，可引起肥大细胞脱颗粒释放活性介质组胺、花生四烯酸和5－羟色胺等;当其作用于体内其他免疫细胞和靶器官时，可引起身体出现过敏反应症状［1］.在食物过敏人群中，约30%的人对花生致敏［2］，李宏等［3］对北京协和医院就诊的过敏患者的调查表明，约有4%的病人对花生过敏，花生过敏在严重情况下可能危及患者生命.李秀敏等［4-7］曾成功建立了花生过敏模型并进行了治疗性的研究，但采用的过敏原只是单一的过敏原分子，不能全面反应人花生过敏的真实途径.目前，国内尚未有建立花生过敏模型的报道，为此，本研究采用灌胃花生粗蛋白方法对Balb/c小鼠进行致敏，探讨小鼠花生过敏的发病机理，为后续研究及开发治疗花生过敏药物提供良好的动物模型.

1 材料与方法

1.1 材料

5～6周龄雌性Balb/c小鼠 (SPF级)购于中山大学动物实验中心;辣根过氧化物酶偶联二抗IgE抗体 (HRP-IgE)和HRP-IgG2a购于美国SouthBiot公司;组胺检测试剂盒购自美国R＆D公司;刘氏染液和伊文思蓝购于珠海贝索生物技术有限公司;IL-4、IL-6、IL-10和IFN-γ细胞因子检测试剂盒购于美国Biolegend公司;其他试剂均为国产分析纯.

1.2 花生粗提蛋白的制备

1.3 小鼠的致敏和激发

16只Balb/c小鼠分为PBS对照组和花生致敏模型组 (简称模型组)，每组8只.致敏方式:模型皮下注射致敏两次，间隔3周，每次注射100 μg花生粗蛋白 (crude peanut extract protein，CPE)和1 mg氢氧化铝佐剂;第2次免疫一周后，皮下注射200 μg CPE进行激发.PBS对照组用相同体积溶液的PBS溶液代替花生粗蛋白，其他与模型组相同.

1.4 小鼠尾静脉注射伊文思蓝

小鼠激发前，对照及实验组分别随机取出2只小鼠，尾静脉注射质量浓度为5 g/L的伊文思蓝100 μL，然后立即皮下注射200 μg CPE进行激发，30～40 min后观察小鼠足部颜色变化.

1.5 眼球取血与腹腔灌洗

鼠眼球取血处死，血液滴入体积分数为2%肝素处理的抗凝管中，3 000 r/min离心10 min，取血清;固定小鼠于解剖板上，剪开皮肤露出腹膜，从腹腔一侧注入3 mL的D-hanks液，轻轻按摩约2 min;在腹腔正中剪开一小口，从小口插入玻璃管反复冲洗肠系膜，用注射器吸取灌洗液于离心管中，取200 μL进行细胞计数;剩余部分 1 000 r/min离心10 min，取上清液于另一新的离心管，－20℃保存备用.用3 mL PBS重悬剩余细胞，取200 μL涂于色甘酸钠预处理的载玻片上，自然风干，刘氏染色 (A液15 s，B液30 s)，显微镜下进行细胞分类统计，观察肥大细胞形态变化.

1.6 空肠组织H＆E切片

取小鼠空肠，剪成0.5 cm小段，用体积分数为10%中性甲醛固定，石蜡包埋，常规切片，H＆E染色.光学显微镜下观察肠道炎症细胞浸润和病理变化情况.

1.7 透射电镜观察肠道组织超微结构病理变化

将空肠组织切成1 mm×1 mm×1 mm大小组织块，经体积分数为3%的戊二醛和体积分数为1%的四氯化锇进行双固定，常规环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅染色，超薄切片，透射电镜观察并拍照.

1.8 血清中IgE、IgG2a、组胺及细胞因子的测定

将1 μg/mL花生蛋白抗原加入到96孔酶标板中，100 μL每孔，4℃包被过夜.PBST洗板5次，加入封闭液，37℃孵育2 h;PBST洗板5次，加入用体积分数为5%的小牛血清PBS稀释液，每孔100 μL，37℃孵育2 h;PBST洗板5次，每孔加入100 μL已稀释的羊抗鼠HRP-IgE(1∶2 000)或羊抗鼠HRP-IgG2a(1∶5 000)，37℃孵育2 h;PBST洗板5次，加入TMB底物，37℃避光显色15 min，加入终止液终止反应，测OD450值.

参照组胺及细胞因子检测试剂盒说明书，酶联免疫吸附法分别测定血清的细胞因子和组胺含量.

1.9 统计学分析

实验组动物与对照组之间比较采用t检验进行数据统计分析.设n为各组样本数，P为t检验概率值，则P＜0.05代表差异显著.

2 实验结果

2.1 花生粗蛋白SDS-PAGE分析

提取的花生粗蛋白进行SDS-PAGE，结果见图1.由图1可知，在55～70 kDa(1 Da=1 u)之间蛋白量最多，花生蛋白中最主要过敏原Ara h1(相对分子质量63.5 kDa)位于这个区间内.BCA法测定花生粗蛋白浓度，定量5 mg/mL分装，用于动物致敏.

（一）对于“新闻阅读”专题和“新诗研究”专题，由于文本内容理解难度不大，可以用1—2节课的时间，直接开展教学。依照先阅读，后分析的原则，由学生首先带着问题进行阅读，而后进行小组讨论研究，最后小组汇报的形式，完成专题研究的过程。

2.2 激发后小鼠体征观察

激发后，模型组小鼠相对于PBS对照组，模型组小鼠出现烦躁不安，腹泻，精神萎靡，挠头搔耳，呼吸急促等症状.

图1 SDS-PAGE鉴定花生粗蛋白成分Fig.1 SDS-PAGE of peanut crud protein

2.3 小鼠血管通透性的变化

PBS组和花生致敏模型组小鼠尾静脉注射伊文思蓝，接着皮下注射花生粗蛋白30 min后，观察小鼠足部颜色的变化，花生过敏组小鼠的足部出现明显的蓝色，且足部组织充血水肿，而对照组未见明显变化，表明花生过敏模型组小鼠血管通透性明显增强 (图2).

图2 PBS组与花生致敏模型组血管通透性观察Fig.2 Blood vessel permeation observation of PBS group and model group

2.4 腹腔灌洗液炎症细胞计数

用细胞计数板对两组Balb/c小鼠腹腔灌洗液的细胞进行细胞总数统计，并用刘氏染液染色，根据细胞核大小及细胞核分叶数等特征区分各种炎症细胞，分类统计数据表明模型组中炎症细胞总数明显升高，其中肥大细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞都呈现显著升高(P＜0.01)，而中性粒细胞、巨噬细胞无明显的变化(P＞0.05)(图3和图4).花生过敏组腹腔灌洗液中肥大细胞明显增大，数目明显增多，细胞膜出现褶皱状，在致敏组活化的肥大细胞周围有明显的颗粒状物质存在，表明肥大细胞已出现脱颗粒.

图3 腹腔灌洗液刘氏染色 (↑指示肥大细胞，×100)Fig.3 Irrigating solution abdominal cavity were stained by Liu'staining solution(↑:mast cell，manification ×100)

图4 腹腔细胞分类与计数Fig.4 Classification and count of the cells of abdominal cavity were classified and counted

2.5 小鼠空肠组织病理变化

空肠下端H＆E切片显示，PBS组肠黏膜结果清晰，肠绒毛排列整齐，绒毛无明显损伤，无炎症细胞浸润;而模型组与PBS对照组相比，花生过敏模型组肠黏膜出现轻度糜烂，排列不整，肠绒毛损伤，呈现以嗜酸性粒细胞为主的炎症细胞浸润现象.表明花生过敏原引起了模型组出现肠道黏膜病变 (图5).通过透射电镜观察发现，对照组微绒毛排列整齐，结构完整，肠紧密连接结构清晰，肠上皮细胞可见大量线粒体，粗面内质网等细胞器，而过敏模型组肠微绒毛绒毛已严重受损，排列紊乱、断裂、缺失，肠上皮细胞结构不清晰，细胞间紧密连接扩大，可见肥大细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞浸润 (图6).

2.6 血清中特异性的IgE和IgG2a水平的改变

图5 空肠下端病理切片 (H＆E染色，×40)Fig.5 The pathological section of ileum(H＆E staining，manification ×40)

图6 透射电镜观察空肠下端病理切片 (TEM，×23 000)Fig.6 Observation of the pathological section of ileum by TEM(TEM，×23 000)

酶联免疫吸附法检测血清中的花生过敏原特异性IgE和IgG2a的水平，模型组 (0.56±0.22，n=8)相对于对照组 (0.17±0.03，n=8)，血清中IgE明显上升 (P＜0.01)，IgG2a水平模型组(0.23±0.03，n=8)较对照组 (0.56±0.02，n=8)明显下降(P＜0.01)(图7).说明花生过敏原引起体内特异性IgE升高，而IgE是活化肥大细胞介导速发型过敏反应前提.IgG2a的下调表明过敏原引起小鼠体内免疫系统偏向于Th2型反应.

图7 血清中IgE与IgG2a抗体水平Fig.7 The levels of IgE and IgG2a in blood serum

2.7 血清组胺和细胞因子的变化

模型组血清中的 Th2型的细胞因子 (IL-4，16.9±1.34，P ＜0.01;IL-5，16±3.51，P ＜0.05;IL-6，121.7±11.84;n=6)较PBS对照组 (IL-4，9.1±1.42;IL-5，8.3±1.15;IL-6，37.4±4.84，P＜0.01;n=6)出现明显上升.Th1型的血清细胞因子模型组 (IFN-γ，133.8±5.45，P ＜0.01;n=6)较PBS组 (IFN-γ，185.4±13.63;n=6)出现显著下调，表明花生过敏原通过调节细胞因子的表达，引起偏向于Th2的过敏反应 (图8).在模型组中血清组胺含量 (27.7±4.29，P＜0.01;n=6)都明显高于对照组(13.4±2.11;n=6)，说明模型组体内的肥大细胞的活化，引起了脱颗粒，并释放组胺，引起速发型过敏反应.

图8 血清中细胞因子水平Fig.8 The levels of cytokine in blood serum

3 讨论

花生过敏是速发型超敏反应，可以影响全身许多脏器，如口腔、消化道、心血管和皮肤等，引起临床各种变态反应症状［8］.花生过敏反应是IgE介导的I型超敏反应，花生总蛋白中含有多种过敏原蛋白成分，包括主要致敏蛋白组分Ara h1和Ara h2，次要致敏蛋白组分Ara h4、Ara h5、Ara h6、Ara h7和Ara h8，它们都可以与特异性IgE结合并诱导人体过敏反应，不同的过敏患者可能对不同的花生过敏原蛋白成分产生过敏反应［9-10］.Balb/c小鼠常用于建立食物过敏模型，相对Ganeshan K等报道的花生过敏模型的建立方法，本实验采用去除脂肪和多糖类物质中的花生粗蛋白 (CPE)对小鼠进行致敏，其致敏性强，更能反映花生作为食品引起的过敏反应［11］，全面表现花生过敏的真实情况，且Balb/c小鼠相对易得，便于实验研究.

Mosmann T R等［12］发现按照细胞产生细胞因子的种类和量的不同，提出了Th1/Th2平衡理论，可将细胞因子的产生分为Th1型和Th2型.Th1型是介导炎症反应和迟发型的变态反应，主要包括IL-2、IFN-γ和TNF-α等，Th2型主要介导的是速发型过敏反应及I型超敏反应，主要包括IL-4、IL-5、IL-6、IL-9和IL-13等.本实验测定了血清中的细胞因子，发现花生粗蛋白引起了Balb/c小鼠血清中IL-4、IL-5和IL-6含量明显上升，IFN-γ出现下降，表明花生粗蛋白上调了Th2细胞因子水平，抑制了Th1因子的水平，导致小鼠体内Th1/Th2失衡.

肥大细胞是过敏反应中的核心细胞，在I型超敏反应中是最重要的效应细胞，当摄入的过敏原进入机体后，抗原会诱导B淋巴细胞产生特异性的抗体IgE、sIgE与肥大细胞表面的Fc受体相结合，从而使肥大细胞处于致敏状态，当机体再次接触到抗原时，肥大细胞表面的Fc受体发生募集反应，激活肥大细胞的内部传导信号，较短时间内导致肥大细胞脱颗粒，释放组胺、白三烯和肝素等炎性介质，进而引起平滑肌收缩、毛细血管扩张等一些过敏反应症状，造成皮肤、消化道和呼吸道过敏反应，甚至全身性过敏反应［13-15］.

本实验对血清中的组胺和花生特异性IgE进行了检测，发现花生致敏组中两者含量都明显上升，这是小鼠发生过敏反应的重要指标之一，对应用小鼠动物模型检测花生过敏原有重要意义.在对小鼠血管通透性检测中，模型组的血管通透性明显增强，提示肥大细胞释放的组胺等介质引起了小鼠血管壁的扩张，从而引起通透性明显增强.通过光学显微镜和电子显微镜观察肠道病理切片，发现模型组出现肠黏膜水肿、肠上皮损伤、肠绒毛断裂等一系列肠道病理变化，说明花生过敏会降低肠道的吸收能力和增强其通透性.向军俭等［16］报道脱颗粒肥大细胞的体积较正常肥大细胞大，胞内有很多致密小颗粒，正常肥大细胞呈圆球形，轮廓清楚完整;脱颗粒细胞形态变的不规则，表面出现一些空洞，轮廓模糊不清.本实验中对腹腔灌洗液中的肥大细胞进行刘氏染色，结果显示，在花生过敏组的腹腔肥大细胞出现明显增大，细胞周围分泌物明显增多，显示肥大细胞呈活化状态.综上研究可知，本实验提供了一种花生过敏建模的方法，并对花生过敏的发病机理及病理特征进行了研究，为花生过敏的预防和治疗奠定了理论基础.

/References:

［1］Sampson H A.Food allergy.When mucosal immunity goes wrong［J］.Journal of Allergy and Clinical Immunology，2005，115(1):139-141.

［2］Nowak-wegrzyn A，Sampson H A.Future therapies for food allergies［J］.Journal of Allergy and Clinical Immunology，2011，127(3):558-573.

［3］LI Hong，ZHANG Hong-yu.Analysis of sensitizing components for peanut allergen［J］.Chinese Journal of Microbiology and Immunology，2001，4(21):12-15.(in Chinese) 李 宏，张宏誉.花生过敏原致敏组分分析［J］.中华微生物和免疫学，2001，4(21):12-15.

［4］Li X M，Srivastava K，Grishin A，et al.Persistent protective effect of heat-killed Escherichia coli producing engineered，allergy［J］.Journal of Allergy and Clinical Immunology，2003，112(1):159-67.

［5］Ganeshan K，Neilsen C V，Hadsaitong A，et al.Impairing oral tolerance promotes allergy and anaphylaxis:a new murine food allergy model［J］.Journal of Allergy and Clinical Immunology，2009，123(1):231-138.

［6］Bol-Schoenmakers M，Bleumink R，Marcondes Rezende M，et al.Diclofenac enhances allergic responses in a mouse peanut allergy model［J］.Clinical＆ Experimental Allergy，2011(41):424-433.

［7］Hughes J L，Brown T，Edgar J D.Peanut allergy and allergic airways inflammation［J］.Pedlatr Allergy Immumunol，2010，21(8):1107-13.

［8］ZHANG Ying-kun，CHEN Hong-bing.The research development in major peanut allergens［J］.Science and Technology of Food Industry，2006，27(3):197-199.(in Chinese)张英坤，陈红兵.花生中主要过敏原的研究进展［J］.食品工业科技，2006，27(3):197-199.

［9］XIA Lixin，YAN Hao，TANG Mu-jin，et al.Bioinformatics comparison of peanut allergen Ara h2 and Ara h6［J］.Journal of Shenzhen University Science and Engineering，2010，27(2):241-246.(in Chinese)夏立新，闫 浩，汤慕瑾，等.花生过敏原Ara h2与Ara h6的生物信息学比较研究［J］.深圳大学学报理工版，2010，27(2):241-246.

［10］YAN Hao，LIU Zhi-gang，LI Li，et al.Cloning，expression and characterization of peanut allergen Ara h6［J］.Science and Technology of Food Industry，2010，31(10):173-181.(in Chinese)闫 浩，刘志刚，李 荔，等.花生Ara h6基因的克隆、表达以及免疫活性鉴定［J］.食品工业科技，2010，31(10):173-181.

［11］Mondoulet L，Dioszeghy V，Ligouis M，et al.Epicutaneous immunotherapy on intact skin using a new delivery system in a murine model of allergy［J］.Clinical and Experimental Allergy，2010，40(4):659-667.

［12］Mosmann T R，Coffman RL.TH1 and TH2 cells:different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties［J］.Annual Review Immunology，1989，7:145-173.

［13］Ito A，Hagiyama M.Oonuma J.Nerve-mast cell and smooth muscle-mast cell interaction mediated by cell adhesion molicule-1，CADM1［J］.Journal of Smooth Nuscle Research，2008，44(2):83-93.

［14］Janet K，Stephen J G.New developments in mast cell biology［J］.Nature Immunology，2008，9:1215-1223.

［15］Sho Yamasaki，Takashi Saito.Progress in allergy signal research on mast cells:signal regulation of multiple mast cell responses through FcεRI［J］.Journal of Pharmacological Sciences，2008，106:336-340.

［16］XIANG Jun-jian，ZHANG Zai-jun，MAO Lu-tian，et al.Histamine releasing from sensitized Mast cells from mouse model stimu la ted by food allergen in vitro［J］.Guangdong Medical Journal.2005，26(5):593-595.(in Chinese)向军俭，张在军，毛露甜，等.食品过敏原体外激发小鼠致敏肥大细胞组胺释放［J］.广东医学，2005，26(5):593-595.