BAPTA-AM对MDCK细胞的保护作用及其机制

施水娟，宋必卫

(浙江工业大学药学院，浙江杭州 310014)

肝功能衰竭(hepatic failure，HF)是一种涉及多器官的临床综合征，由大面积的肝细胞死亡引起，很快发生多脏器功能衰竭，死亡率高达60% ～90%。目前临床无有效治疗药物。肝肾综合征(hepatorenal syndrome，HRS)是在严重肝病时发生的急性肾功能衰竭，是HF的重要并发症与死亡原因。HRS加重病情，使治疗更复杂。理论上，一个药物对肝、肾细胞均有强力保护作用，则用于治疗HF更佳:既治疗原发病，又能改善并发症。我们发现进入细胞后活化的高效钙络合剂 BAPTA-AM［1，2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N，N，N＇N＇-tetraacetic acid］对肝细胞有很强的保护作用，有望开发成肝衰的治疗药［1－2］。

D-氨基半乳糖(D-galactosmine，D-GalN)诱导急性肝损伤模型是目前公认最好的模拟病毒性肝炎病理变化的实验模型［3］。本文以D-GalN攻击肾小管细胞(MDCK细胞)以模拟肝肾综合症时的肾细胞损伤，通过测定细胞活力，线粒体膜电位(△Ψm)，凋亡通路关键酶 Caspase-8、Caspase-9的激活等指标评价D-GalN对肾细胞的毒性和BAPTA-AM的对肾细胞的保护作用及其作用机制，探讨其对肝肾综合症的有益影响，进一步论证BAPTAAM的治疗学价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 MDCK细胞株购自 American tissue culture center(ATCC);D-GalN购自重庆医科大学;BAPTA-AM 购自 Gibco公司;Rhodamine123、MTT、A23187、Fura-2/AM购自Sigma公司;Annexin V-EGFP、Hoechst33342/PI购自南京凯基生物技术有限公司;Caspase-8、Caspase-9活性检测试剂盒购自海门市碧云天生物技术研究所;MEM培养液、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS购自上海吉诺医药生物技术有限公司。

1.1.2 仪器 垂直流超净台(ESCO);CO2培养箱(Forma 3111);倒置荧光显微镜(Leica Devices);酶标仪(Molecular Devices，Spectramax M2e);离心机(Heraeus，LDZ5-2)。

1.2 方法

1.2.1 D-GalN诱导MDCK细胞损伤模型的建立将MDCK细胞以104/孔接种于96孔板，MEM培养液，5%CO2，37℃培养至细胞生长到70% ～80%孔面积。每组设6个复孔，实验重复3次。……