新疆南疆猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株分型鉴定

崔浩然 刘永宏 赵 丽 焦海宏 张志峰 刘俊峰

(塔里木大学动物科学学院/新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔市，843300)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus，PRRSV)引起猪的一种高度接触性传染病，不同年龄、品种和性别的猪均可感染，但以妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最易感，该病以母猪的流产、死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔猪的呼吸困难、败血症、高死亡率等为主要特征[1]。

目前，PRRS严重威胁着全球养猪业和世界公共卫生，给经济带来巨大的损失，仅美国因该病每年至少要花费5.6亿美元[2]，权威组织评价每头生长猪出栏前因PRRS花费5.60美元～7.60美元。

2006年春夏之交，我国从南向北25个以上省、市、自治区暴发以高热、高发病率、高死亡率和低治愈率为特征的“猪高热病(porcine high fever disease，PHFD)”，至少200多万头猪发病，死亡40万头之多，2007年7月田克恭等及农业部[3]将其确诊为高致病性猪繁殖与呼吸综合征(Highly Pathogenicity Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，HP－PRRS)，JXA1株为HP－PRRSV代表株，属于美洲型。并将HP－PRRS确定为中国一类动物疫病[3]，普通毒力的PRRS确定为中国二类动物疫病。

PRRSV为单股正链RNA病毒，根据抗原性差异将各地PRRSV分离株分为两个型，即欧洲型(Ⅰ型)和美洲型(Ⅱ型)，原型株分别为LV株和ATCC VR－2332株[4]。PRRSV基因组全长约15kb，至少编码9个相互重叠的开放阅读框架(Open reading frame，ORF)，即ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7[5]。ORF5、ORF6和ORF7编码三个主要的结构蛋白，分别为被膜蛋白GP5、膜蛋白M和核衣壳蛋白N[5]。和欧洲型原型株LV株相比，北美型N蛋白核苷酸同源性仅约63%，氨基酸同源性仅约59%的水平[6]。如此相对高的偏离原因为多个核苷酸置换、插入和缺失引起，使北美型N蛋白比欧洲型LV株少了5个氨基酸[7] 。

考虑新疆南疆周邻多国的地理位置、戈壁沙漠地域较广和干旱气候等特点，以及PRRSV高变异性[7]和抗体依赖性增强[8]等特点，新疆南疆毒株可能有其自身的、不同于国内外其他毒株的特点。本研究拟针对新疆南疆PRRSV ORF7部分因序列进行遗传演化分析，讨论所得毒株类型，为新疆南疆有效防制PRRS提供依据和技术储备。现结果报告如下:

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料

采自新疆南疆阿克苏和库尔勒地区发病自然死亡猪只。阳性对照为上海海利/蓝耳病活疫苗/高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(HuN4－F112株)。

1.1.2 主要试剂盒

Trizol invitrogenTM(Code No.:15596－026)，购自Invitrogen生物工程有限公司;TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0(Code No.:DRR019A)，Premix Taq Version2.0(Code No.:D331A)，购自宝生物工程(大连)有限公司;TIANgel Midi Purification Kit(Code No.:DP209)，TIANprep Mini Plasmid Kit(Code No.:DP103)，pGM－T克隆试剂盒(Code No.:VT202)，DNA markerⅡ(Code No.:MD102)，DNA markerⅢ(Code No.:MD103)均购自天根生化科技(北京)有限公司;等。

1.1.3 PRRSV参考毒株

PRRSV参考毒株均下载于NCBI数据库，毒株名称、大小和GenBank登录号见表1。

1.1.4 引物

按照引物设计原则，利用Primer Premier5.0分子生物学软件，以GenBank数据库中保守的PRRSV基因序列为参照设计特异性引物，跨度300bp左右，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。具体序列如下:上游引物:5'－AATGGCCAGCCAGTCAATCA－3';下游引物:5'－GAATCAGGCGCACTGTATGA－3'。

表1 参考毒株

1.1.5 仪器

PCR仪(TC－5000，Bibby scientific Ltd)，小型高速冷冻离心机(R134a，Hermetically sealed refigeration system)，电泳仪(DYY－12，北京市六一仪器厂)，紫外分析仪(JY02S，北京君意东方电泳仪设备有限公司)，等。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取

从病死猪肺脏等混合组织中提取总RNA，按Trizol invitrogenTM试剂盒说明书操作。

1.2.2 RT－PCR反应

总RNA按照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒，利用自行设计的特异性引物，进行一步法扩增ORF7基因片段，退火温度54.1℃。设立阳性对照(弱毒疫苗)和阴性对照(蒸馏水)。

1.2.3 PCR产物纯化回收

取ORF7基因RT－PCR扩增产物电泳切胶后，按照TIANgel Midi Purification Kit试剂盒说明进行回收纯化。

1.2.4 纯化产物连接T载体

胶回收纯化目的产物与pGM－T载体连接，按照pGM－T克隆试剂盒说明操作。

1.2.5 转化DH5α感受态细胞、鉴定、摇菌及提取质粒送测序

将连接产物转化自制的感受态细胞DH5α，进行蓝白斑筛选。白色菌落利用Premix Taq?Version2.0试剂盒进行菌落PCR鉴定，挑取多个PCR阳性菌落摇菌，按照TIANprep Mini Plasmid Kit试剂盒提取质粒DNA，标记为XJNJ－4－1、XJNJ－4－3、XJNJ－5－2、XJNJ－5－3、XJNJ－9－1、XJNJ－9－2、XJNJ－13－1、XJNJ－13－2、XJNJ－14－1、XJNJ－14－3、XJNJ－18－1、XJNJ－18－2、XJNJ－19－2和XJNJ－19－3，送生工生物工程(上海)有限公司测序，测序引物为T7。

1.2.6 序列分析

用DNAMAN和DNAStar生物学软件进行序列比对和遗传演化分析。

2 结果与分析

2.1 ORF7基因RT－PCR扩增结果

利用ORF7基因特异性引物，对发病疑似PRRS猪组织病料总RNA进行RT－PCR扩增，将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。结果显示，14例PRRSV阳性，分别命名为PRRSV XJNJ－4－1、XJNJ－4－3、XJNJ－5－2、XJNJ－5－3、XJNJ－9－1、XJNJ－9－2、XJNJ－13－1、XJNJ－13－2、XJNJ－14－1、XJNJ－14－3、XJNJ－18－1、XJNJ－18－2、XJNJ－19－2和XJNJ－19－3株，得到的目的基因片段与预期的大小一致，对照成立(图1)。

图1 ORF7基因RT－PCR扩增结果

2.2 ORF7基因核苷酸序列比较分析

RT－PCR阳性产物胶回收纯化，连接pGM－T载体，转化自制的感受态细胞DH5α，白色菌落进行菌落PCR鉴定，挑取PCR阳性菌落摇菌，提取质粒DNA，送生工生物工程(上海)有限公司测序，获得了14个ORF7基因部分片段序列。

本研究获得的14个新疆南疆PRRSV毒株与6个国内代表毒株(2006年中国暴发HP－PRRS代表株JXAl，中国另外一个HP－PRRSV毒株HuN，中国自然弱毒疫苗株R98，JXA1致弱株JXA1 P80和中国代表株CH－1a及其致弱株CH－1R)和3个国外代表株(进口美洲型疫苗株MLV，美洲型代表毒株VR2332和欧洲型代表毒株LV)相应的ORF7基因序列进行序列比对分析，结果显示本研究获得的14株、国内6株参考株以及进口美洲型疫苗株MLV和美洲型代表毒株VR2332都不存在9个碱基的缺失，只有欧洲型代表毒株LV该位置有9个碱基的缺失，结果与预期设计相符(图2)。

图2 ORF7片段中核苷酸的缺失

2.3 ORF7基因核苷酸序列遗传进化树

将本研究获得的14个PRRSV毒株ORF7基因部分片段，与参考的9株PRRSV截取相应位置长度的ORF7基因序列，进行核苷酸比对，绘制了23个毒株的发育进化树。如图3所示，本研究的14株均与中国代表株CH－1a及其致弱株CH－1R、2006年中国暴发HP－PRRS代表株JXAl及其致弱株JXAl P80、中国另外一个高致病性毒株HuN、中国自然弱毒疫苗株R98、进口美洲型疫苗株MLV和美洲型代表毒株VR2332在同一个大的分支，均不与欧洲型代表株LV在一个分支。另外，XJNJ－5－2和XJNJ－5－3株与2006年中国暴发HP－PRRS代表株JXAl及其致弱株JXAl P80和中国另外一个高致病性毒株HuN在同一个小的分支内。

3 讨论

1996年郭宝清等[9]首次从北京流产胎儿体内分离到PRRSV，从而证实PRRS已在我国存在。随后，该病在中国各省市相继均有报道。2006年，中国猪养殖场由南向北暴发一次毁灭性灾难－HPPRRS。中国新疆其他省市对PRRS研究较多，新疆对该病的研究属于探索阶段。新疆地处中国西北边陲，周边与8国接壤，尤其在俄罗斯流行PRRSV欧洲型毒株，与中国流行的美洲型毒株有明显差异。另外，中国台湾[10]、中国内地检疫口岸以及内地一些地区有欧洲型毒株的报道。之前的研究，两洲分离株属于两个不同的基因型，各洲野外分离株和各洲起源株有高度的亲缘关系，亚洲国家PRRSV遗传学关系显示为美洲型[11]。近年来，PRRSV的流行早已打破原来的地域限制，在亚洲和北美均有欧洲型PRRSV流行的报道，欧洲也出现了野生型PRRSV的美洲株。所以，有必要研究分析清楚新疆南疆PRRSV流行毒株的类型及特点，以便于更好的预防和控制新疆南疆PRRS。对于PRRSV的相关基因的变异性研究是十分必要的，在此基础上进行合理的种毒株选择，疫苗设计和制备，以便提出有效的防控措施和防制计划。

PRRSV的ORF7基因，是除ORF6基因以外保守性最高的编码结构蛋白的基因[12]，美洲型毒株间氨基酸的同源性为96%～100%，欧洲型毒株间氨基酸同源性为94%～99%，但欧洲型与美洲型毒株之间N蛋白氨基酸的同源性仅为63%，氨基酸同源性仅为59%[6]。本研究针对相对保守的ORF7基因，设计了可以同时扩增欧洲型和美洲型PRRSV毒株ORF7基因部分片段的特异性引物，扩增片段包括欧洲型毒株9个核苷酸片段的缺失区，针对此用于区分欧洲型和美洲型毒株。同时，本研究病料均采自新疆南疆发病疑似PRRS猪只，且均来自未免疫PRRS弱毒疫苗猪场，所以此次阳性结果表明该猪场存在PRRSV感染。本研究通过RT－PCR有14例PRRSV阳性，说明该组织样品来源猪场存在PRRSV感染。RT－PCR阳性产物克隆测序获得的14个ORF7基因片段，均没有该位置9个核苷酸的缺失。同时结合参考的9株PRRSV代表株，截取相应位置长度的ORF7基因序列，进行核苷酸序列比对得到的进化树显示，本研究的14株均与中国代表株CH－1a及其致弱株CH－1R、2006年中国暴发HP－PRRS代表株JXAl及其致弱株JXAl P80、中国另外一个高致病性毒株HuN、中国自然弱毒疫苗株R98、进口美洲型疫苗株MLV和美洲型代表毒株VR2332在同一个大的分支，均不与欧洲型代表株LV在一个分支。以上结果综合表明，本研究采集样品猪场感染了PRRSV美洲型毒株，同时说明这些猪场没有感染欧洲型毒株。

另外，进化树显示XJNJ－5－2和XJNJ－5－3株与2006年中国暴发HP－PRRS代表株JXAl及其致弱株JXAl P80和中国另外一个高致病性毒株HuN在同一个小的分支内，因为本研究病料均采自未免疫PRRS弱毒疫苗猪场，所以XJNJ－5－2和XJNJ－5－3株属于高致病HP－PRRSV毒株

至于更准确的结论，以及新疆南疆更多毒株的获得及毒株特点分析，会在将来的工作中逐步进行，从采样点全面、毒株数量多等方面考虑，最终监测新疆南疆PRRSV毒株类型及特点，以便及早的发现新毒株和新特点，提出更加有效的防制对策，减少因PRRS造成新疆南疆养猪业损失。

4 结论

本实验未检测到欧洲型毒株，获得的14个新疆南疆地区PRRSV毒株均属于美洲型毒株，其中2株属于美洲型高致病性HP－PRRSV毒株。

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