饲料香味剂中香味成分检测方法研究

游飞明

（1.福建省产品质量检验研究院，福建福州350002；2.国家加工食品质量监督检验中心（福州），福建福州350002）

饲料用香味剂是通过利用畜禽嗅觉、味觉等生理学原理，用来改善和增强饲料天然口味与气味，增强动物食欲，提高动物采食量，促进饲料消化吸收与利用，而添加于饲料中的特殊添加物，其在饲料配方中一直占有举足轻重的位置。香味剂成分主要来源于植物的根、茎、叶、果及其提取浓缩料和人工化合物[1-2]。乳酸乙酯、乙基麦芽酚及乙基香兰素等在饲料中作为香味剂成分已得到广泛使用。乳酸乙酯是香味剂中最常用的香基成分，特别适用于猪仔的香味剂[3]；乙基麦芽酚本身具有特有焦香气，又能对某一个成分的香味起增效作用，因此，是饲料香味剂不可或缺的成分；乙基香兰素具有强烈香荚兰豆香气，香气强度是香兰素3～4.5倍，具有增香和定香作用，也是饲料香味剂常用的成分[4]。近几年研发生产的饲料香味剂中通常含有这三种物质中一种或全部。

目前，我国饲料添加剂产品质量的检测方法标准还不完善，大多数饲料添加剂产品尚无国家或行业检测方法标准，如饲料香味剂中乳酸乙酯、乙基麦芽酚及乙基香兰素没有相关的检测方法标准，国内外相关研究报道也较少。这些组分检测方法有紫外分光光度法、气相色谱法、液相色谱法、气相色谱质谱法、液相色谱串联质谱法等，研究的对象以食品为主[5-13]，采用气相色谱法同时检测饲料香味剂中乳酸乙酯、乙基麦芽酚及乙基香兰素研究工作未见报导。本研究通过检测条件摸索优化和样品前处理方法摸索筛选，建立饲料香味剂中香味成分乳酸乙酯、乙基麦芽酚、乙基香兰素含量检测方法。该方法的建立为制订国家或行业检测方法标准奠定基础，对规范饲料添加剂生产、提高饲料添加剂产品质量、营造公平的饲料添加剂市场竞争环境都具有十分重要的意义。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

GC-2010（配火焰离子化检测器、AOC-20i自动进样器、GC solution工作站）气相色谱仪（日本岛津公司）；色谱柱 ZB-WAXplus，30 m×0.32 mm×0.25 μm(美国菲罗门公司)；XW-80A涡旋混合器（上海精科实业有限公司）；丙酮，分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；乳酸乙酯：纯度＞99.0%（Fluka）；乙基麦芽酚：纯度＞99%（Sigma）；乙基香兰素：纯度＞97.3%（Chroma DEX）。

1.2 标准储备液的配制

分别称取0.25 g(精确到0.000 1 g)乳酸乙酯、乙基麦芽酚、乙基香兰素参考物质于25 ml容量瓶中，以丙酮溶解并定容，则该标准储备液中乳酸乙酯、乙基麦芽酚、乙基香兰素浓度均为10.0mg/ml，于4℃冰箱保存。

1.3 样品溶液制备

称取试样1 g（精确到0.000 1 g）于25 ml容量瓶中，加入丙酮15 ml，涡旋混合1 min，用丙酮定容，充分摇匀，静置5 h，取上清液过0.45 μm的微孔滤膜，供上机测定。

1.4 色谱条件

柱温箱温度：65℃ 保持4 min，以30℃/min上升到 245℃ 保持5 min；气化室温度：250℃；检测器温度：280℃；载气：氮气（纯度≥99.999%），初始柱流量：3.0 ml/min，尾吹气流量：30 ml/min，进样量：1 μl，分流比：30∶1。

2 结果

2.1 方法的线性范围

将标准储备液逐级稀释配制成标准工作溶液，浓度为0.02、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/ml，标准工作溶液依次从低浓度到高浓度进样，每一浓度进样两针，按其所得峰面积的平均值为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标拟合标准曲线，计算出回归方程和相关系数。实验结果见表1。

表1 3种饲料香味剂的回归参数

2.2 方法的精密度

2.2.1 仪器的精密度

取浓度为2.0mg/ml标准溶液按选定的色谱条件重复进样6次，得乳酸乙酯、乙基麦芽酚、乙基香兰素的峰面积，计算其相对标准偏差RSD分别为0.8%、1.0%、1.1%，说明仪器重复性满足要求。

2.2.2 方法的精密度

选取含有乳酸乙酯、乙基麦芽酚、乙基香兰素的香味剂样品，按1.3规定样品溶液制备方法和1.4节规定的色谱条件进行6次平行测定。实验结果（见表2）表明方法精密度高。

表2 方法重复性实验结果（n=6）

2.3 方法的回收率

为了考察方法的准确度，在已知含量的样品基质中加入一定量标准混合液进行加标回收率实验，加标浓度分3个水平，每个水平平行测定4次，依添加前后测定值的差值与实际添加量的百分比分别计算回收率，结果（见表3）表明方法回收率高。

表3 加标回收率实验结果(n=4)

2.4 提取率考察

基于香味剂中香味成分易于挥发，含量随储存时间增长而降低，本实验选择含量较为稳定的组分乙基香兰素的含量为表征对象考察提取率。取理论添加量为80 g/kg的香味剂进行提取测定，结果为74.4 g/kg，提取率为93.0%，提取率较高，能满足要求。

2.5 稳定性考察

2.5.1 标准溶液稳定性

将浓度为3mg/ml标准混合液在4℃冰箱中放置3个月后，与新配制的浓度相近的标准溶液同时进样分析，以新配制的标准溶液为对照测定放置3个月后的旧标准溶液浓度值，计算测定平均值与配制时理论值的相对偏差。测定结果（见表4）表明标准混合液在4℃冰箱中放置3个月浓度值基本保持不变，标准溶液稳定有效。

表4 标准溶液稳定性

2.5.2 样品溶液稳定性

样品按1.3规定的方法制备后，分别取静置2、5、24、48 h的上清液进样分析，结果（见表5）表明样品溶液中组分含量静置5 h达到平衡，静置5～24 h保持稳定，静置48 h乙基麦芽酚含量有所下降。所以，样液上机分析最佳时间为静置5～24 h。

表5 样品溶液稳定性(g/kg)

2.6 样品测定

收集不同香味剂样品，按本文建立的方法进行检验，结果见表6。4个样品测定结果均达到规定限值，有1个样品检出乙基麦芽酚，但标签未标示。因此，尽快建立饲料香味剂含量检测方法，发布相关检测标准，有助于规范饲料调味剂生产，为科学、安全饲养畜禽提供依据。

表6 样品测定结果(g/kg)

3 讨论

3.1 检测条件优化

3.1.1 色谱柱的选择

色谱柱固定相类型是影响组分分离效果的重要因素。本研究综合考虑组分极性和化学结构,参考文献[9-11],选择极性柱ZB-WAXplus(30 m×0.32 mm×0.25 μm)和弱极性柱ZB-5(30 m×0.32 mm×0.25 μm)进行实验比较，结果乳酸乙酯、乙基麦芽酚、乙基香兰素在ZB-5柱上出峰时间较长，组分间出峰间隔较长，要缩短分析时间需要更高的升温速率，造成基线漂移较大。综合考虑峰形、灵敏度、分析时间，基线漂移等因素，选用ZB-WAXplus(30 m×0.32 mm×0.25 μm)色谱柱。

3.1.2 柱温和柱流量的优化选择

除了色谱柱，柱温和柱流量也是影响组分分离效果的主要因素。基于乳酸乙酯、乙基麦芽酚、乙基香兰素沸点差异较大，同时考虑溶剂聚焦、灵敏度等因素，本研究反复实验比较了不同的初始温度、升温速率、柱流量后,确定升温程序为:初始温度为65℃,保持4 min,以30℃/min上升到245℃，保持5 min，初始柱流量为3 ml/min。

在选定的色谱条件下，组分峰形对称尖锐，分离效果好，分析时间合理。标样色谱图和样品色谱图见图1。

图1 标样和样品色谱

3.2 样品前处理方法摸索筛选

饲料香味剂大致有液体型和固体型两类，固体型又有吸附型和喷雾干燥型两种。固体吸附型香味剂由具有一定吸附性的载体和香味成分通过加工制备而成，载体含量通常达到80%以上[14-15]。由于载体对香味成分具有一定的吸附性，如何将香味成分充分、有效地从载体中提取出来成为本研究技术核心。目前市面上香味剂以固体吸附型为主，因此本研究以固体吸附型香味剂为研究对象。

3.2.1 提取溶剂的选择

乳酸乙酯、乙基麦芽酚、乙基香兰素均能溶于乙醇，参考前人经验[9-11]，选择无水乙醇为提取溶剂。但在考察样品溶液稳定性试验中发现，样品溶液中乳酸乙酯和乙基麦芽酚含量随着放置时间延长不断提高，直到24 h才基本稳定，而乙基香兰素含量基本稳定不变（结果见图2），说明用无水乙醇很难在短时间内将乳酸乙酯和乙基麦芽酚从载体中充分提取出来。

图2 放置时间对提取结果的影响

丙酮、三氯甲烷对目标组分均有较好溶解性，且对基质有较好的渗透力。在同等条件下比较丙酮、三氯甲烷和无水乙醇对目标组分的提取效果，结果发现丙酮提取效果最好，无水乙醇次之，三氯甲烷最差，具体数据见表7，因此选择丙酮做为提取溶剂。

表7 不同溶剂提取结果(g/kg)

3.2.2 提取方法选择

提取方法通常对提取效率有较大影响。试验比较采用涡旋混合1 min，震荡提取5 min，超声提取5 min和超声提取30 min，静置2 h，取上清液进样，结果不同提取方法组分含量无明显差异。选择涡旋混合1 min做为样品提取方法。

3.3 干扰试验

饲料香味剂香味成分较多，如果样品中共存的香味成分多可能会互相干扰，为了考察另外几种常用香味成分是否对本方法干扰，在标样中加入浓度相近的乳酸丁酯、麦芽酚、甲基环戊烯醇酮，按1.4节规定的色谱条件进样分析，分离结果见图3。从分离结果和峰面积判断，这些组分对乳酸乙酯、乙基麦芽酚、乙基香兰素定性和定量均无干扰。

图3 添加了其他香味成分的色谱

3.4 定量方法选择

外标法和内标法是色谱分析中最常用的定量方法，内标法定量结果受仪器条件和进样量等因素影响较小，然而内标物的选择较难，需要保证样品基质在内标处没有干扰峰。外标法样品制备过程简单，但是定量结果受仪器条件和进样量等因素影响较大，现在多数仪器配置自动进样器，载气流量用电子流量阀控制，仪器条件和进样量重现性较好，克服了外标法定量的缺点。为了考察定量方法是否对测定结果有影响，同一样品分别用外标法和内标法（甲基环戊烯醇酮为内标）重复测定4次，取平均值比较，结果（见表8）无明显差异，故本研究选择外标法定量。

4 结论

本研究建立的气相色谱法测定饲料香味剂中香味成分乳酸乙酯、乙基麦芽酚、乙基香兰素含量方法，具有样品前处理操作简单，提取效果高，特异性强的特点，方法线性范围宽，线性关系好，加标回收率高，重现性好；使用仪器设备普及率高，可在饲料添加剂质量检测中加以推广应用。该方法为正在制订的福建省地方标准《饲料调味剂中六种香料成分含量的测定-气相色谱法》提供技术研究基础。

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