重组H8N4亚型禽流感病毒的拯救

崔鹤馨 ，李 沂 ，田宇飞 ，袁 森 ，凡 敏 ，靖 杰 ， 齐延新 ，郭欢欢 ，田明尧， 金宁一

（1.吉林大学畜牧兽医学院，长春1300621；2.军事医学科学院军事兽医研究所，长春 130122；3.吉林农业大学动物科技学院，长春 130118）

流感病毒是负链RNA病毒，基因组是分节段的。最初研究人员通过纯化RNPs蛋白来获得流感病毒；1989年，研究人员通过辅助病毒获得了流感病毒；1999年，Neumann等和Fodor等建立了能完全从克隆的cDNA产生流感病毒的新技术，首次通过12质粒系统拯救出流感病毒。至此，反向遗传操作技术取得了突破性进展。但当较多数量的质粒一起进入细胞并协调表达时，病毒的拯救效率会受到影响。为了减少质粒数量，2000年Hoffmann等[1]建立了双向转录表达载体的8质粒系统, 即在同一载体上实现vRNA的转录和病毒蛋白的表达。编码vRNA的cDNA正向插入到RNA聚合酶Ⅱ启动子（从人巨细胞瘤病毒CMV启动子衍化而来）和终止序列（牛生长激素poly（A）信号aⅡBGH）之间，并一起反向插入了人RNA 聚合酶Ⅰ启动子（PⅠh）和鼠RNA 聚合酶Ⅰ终止序列（tⅠ），这一系统采用共培养293T 细胞和MDCK细胞, 因为人的RNA 聚合酶I启动子只能在人源或相近种属动物细胞才能表现较高的活性。8个质粒转染真核细胞后，在同一个模板上由RNA聚合酶Ⅰ控制合成负链vRNA，由RNA聚合酶Ⅱ控制合成正链mRNA，转染的293T细胞中产生的病毒随后感染MDCK细胞并大量复制并表达蛋白质。 该系统最大的优点在于不需要构建专门的蛋白表达质粒，使得反向遗传学系统产生流感病毒的时间和成本也随之缩短和降低。另外，该系统广泛应用于多种负链RNA病毒的拯救,如狂犬病毒、牛瘟病毒、新城疫病毒、水疱性口膜炎病毒、麻疹病毒等[2-7]。……