绿脓杆菌分子生物学检测的研究进展

张昕悦，张秀军，*，何聪芬，高 路

(1.河北联合大学生命科学学院，河北唐山063000;2.北京工商大学理学院，北京100048)

绿脓杆菌分子生物学检测的研究进展

张昕悦1，张秀军1，*，何聪芬2，高 路2

(1.河北联合大学生命科学学院，河北唐山063000;2.北京工商大学理学院，北京100048)

绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种临床上常见的条件致病菌。近年来其检测技术取得了一定进展，本文对绿脓杆菌的分子生物学检测技术进行了综述，并对其检测新策略进行了展望。

绿脓杆菌，分子生物学，检测

Abstract:Pseudomonas aeruginosa is a common opportunistic pathogen.Some improvement has been made on its relevant detection technique in recent years.The molecular detections of Pseudomonas aeruginosa and some new promising strategies about its testing were summarized in the review.

Key words:Pseudomonas aeruginosa;molecular biology;detection

绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)亦称铜绿假单胞菌，是一种常见的条件致病菌，自然界广泛分布于空气、水和土壤中。该菌可以产生包括多糖荚膜、黏附素、内毒素和外毒素在内的多种致病因子，并通过阻止真核细胞的蛋白质合成、催化过氧化氢和超氧化物产生有毒氧基团的方式引起机体组织损伤。该菌附着在人身上可引起人皮肤化脓性感染，特别是患者的烧伤或烫伤部位被感染后，常会使病情恶化，并可能引起败血症［1］。此外，绿脓杆菌也可以通过污染食品而造成食物中毒。目前我国对绿脓杆菌的检测主要停留在细胞培养阶段，该方法存在特异性与敏感性低、耗时长、诊断方法繁琐、确诊率低等缺陷，不宜用于大规模食品、化妆品、环境样品检测推广，另外在临床上还有可能延误诊断和治疗。因此，研究绿脓杆菌的分子生物学检测方法具有十分重要的现实意义，本文对相关研究进展做一综述。

1 传统的绿脓杆菌检测方法

1.1 细菌培养法

传统检测绿脓杆菌的方法就是通过选择性增菌、接种、分离、生化鉴定等方法对待检样品可能存在的绿脓杆菌进行定性和定量的检测。其中选择性增菌用的是SCDLP增菌液;梯度稀释菌液后接种平板可以定量计数;分离培养用到CFC平板与CN平板置于36℃培养24h;依据绿脓杆菌氧化酶、硝酸盐还原、明胶液化实验、乙酰胺、葡萄糖酸盐、精氨酸双水解酶实验呈阳性，革兰氏染色、赖氨酸脱羧酶实验为阴性，42℃琼脂斜面上能生长等生化鉴定特征［2］，报告样品中是否检出绿脓杆菌。培养法简单易行，结果准确，但耗时长及其繁琐的步骤是该方法发展难以突破的瓶颈。

1.2 VITEK检测法

VITEK全自动微生物分析系统是法国biosMerieumx生产的全自动微生物分析仪的一个系列，是目前世界上最先进、自动化程度最高的细菌鉴定器之一，仪器的原理是依据细菌的生化反应，即把30个对细菌鉴定必需的生化反应培养基固定到卡片上，然后通过自动试卡阅读器按光学扫描原理，定时测定各生长介质中指示剂的显色或浊度反应，形成各自特有的“代谢指纹图谱”，通过计算机分析处理，从而获得鉴定［3］。该方法具有高度的特异性、敏感性和重复性，操作简便，检测速度快。但是其鉴定结果受到多种因素的影响，仍有一些菌不能经VITEK进行有效鉴定。这种现象出现的原因包括:待检菌不纯;接种浊度不合要求;接种物孵育时间过长;超出实验卡鉴定范围;菌悬液不乳化;冲液时气泡过多等。除以上原因外，还有一些不能确定的因素也可导致不能有效鉴定。这说明VITEK仪器受外界干扰的因素较多，因此其使用受到一定的限制。

2 绿脓杆菌的分子生物学检测方法的发展

2.1 常规PCR

PCR是从极微量模板DNA产生微克量DNA的一种快速、经济、简单的方法。尤其适合应用于培养较困难或血清学方法不易检测的病原微生物，以及在突发公共卫生事件中时间要求紧迫的微生物检测工作。目前常规PCR用到的靶基因有algD，oprL，ETA，16S rDNA等，主要是应用于食品微生物的诊断和食源性疾病的鉴定。文献报道Luiz等人［4］用algD基因为靶基因检测绿脓杆菌，用于临床上检测囊肿性纤维化痰样;Jiru Xu等［5］通过对靶基因oprL和ETA基因的研究，发现绿脓杆菌的PCR检测选用oprL基因要比ETA基因更敏感;Theodore Spilker等［6］为了在亲缘性相近的假单胞菌属之间做到更好地识别，用16S rDNA来设计引物。通过国外的报道还可以看出，国外对于绿脓杆菌的检测主要是用于临床上囊肿性纤维化患者病情的监测［7］。PCR检测方法的敏感性高于细胞培养法，然而细胞培养法的检测特异性则高于PCR法。这是因为普通PCR引物单一，无法满足微生物种属鉴定上所需的特异性。而且该方法在琼脂糖凝胶电泳过程中，PCR扩增产物分离的效果有时不理想，实验后有时会出现交叉污染的情况，均会导致假阳性或假阴性结果的出现。

2.2 多重PCR

多重PCR技术是常规PCR技术的一种延伸，它的扩增体系中需要含有多对引物，可同时完成多个目的片段的扩增，达到同时检测多种致病菌或者病原菌分型的目的。Daniel等［8］利用oprL与oprI两基因，在两基因同时扩增检测具有同步放大行的基础上，区分荧光假单胞菌和绿脓杆菌。多重PCR检测结果产生影响的关键因素之一是引物的设计，要求所有设计引物的退火温度必须十分接近，扩增产物大小的差别也要够大以能够将其在琼脂糖凝胶电泳中区分开来。韩国学者Eui-Suk Jeong等［9］利用一段绿脓杆菌的高保守基因组片段设计引物，扩增产物长达726bp，与肝螺杆菌和沙门杆菌的扩增产物明显区分开来。同时，多重PCR的各引物扩增之间也不能产生干扰，这在引物对数量多的反应体系中十分重要。为了解决扩增之间的竞争问题，也有研究建议在多重PCR引物两端加上接头［10］。有研究显示目前正开发出一种通用引物，这样就可以完成多种菌的同时高效检出。

2.3 PCR－DHPLC

PCR结合了变性高效液相色谱技术(PCRDHPLC)是最近几年来发展起来的一种灵敏、快速、准确的基因检测技术，已经被广泛应用于基因诊断、突变检测、分型鉴别等检测中。曹际娟等［11］报道了采用PCR-DHPLC技术，以绿脓杆菌外毒素A(ETA)基因作为靶基因研究绿脓杆菌检测的新方法，该方法采用高压闭合液相流路，将DNA样品自动注入并与缓冲液一起流过DNA分离柱，通过缓冲液不同的梯度变化，在不同温度条件下，由荧光系统检测已被分离的DNA样品，来实现对DNA不同的分析。该技术目的是更快速、更准确、高灵敏度、高通量地检测食品、化妆品、临床样本及环境样本中的绿脓杆菌。

2.4 Real－time PCR

实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术的出现，无疑给PCR检测领域又注入了新的活力，该技术不仅实现了PCR由定性到定量的飞跃，而且与普通PCR相比，它结合了PCR技术的高灵敏度和核酸杂交技术的特异性。它的特异性更强、能有效解决PCR污染问题、自动化程度更高，目前在国内外广泛用于基因表达研究、转基因方面研究、病原体检测等领域［12］。Real-time PCR技术，它是在常规PCR的基础上，添加了一条标记了两个荧光素标记的探针。一个是探针5＇端的荧光报告基团(R);另一个是3＇端的荧光淬灭基团(Q)。探针完整或位置很近时，报告基因发射的荧光被淬灭荧光基团吸收，当PCR扩增时，Taq酶的5＇-3＇外切酶将探针上的荧光基团酶切降解，使两基团分离，抑制作用消失，从而使报告基团荧光信号被检测到。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子发荧光，通过荧光信号的累积来实现与PCR产物形成完全同步。

国内在相关领域的研究较少，但是也有了初步的进展。如薛利军等［13］用特异性引物扩增16S rDNA靶片段，通过构建重组质粒将梯度稀释质粒作为模板建立标准曲线，以SYBR Green I作为荧光染料对不同浓度的绿脓杆菌DNA样品进行Real-time PCR检测，该体系可在2h内完成检测，同时显示了良好的特异性和灵敏度，可以用于医院细菌感染的鉴定。随着研究的深入发现16S rDNA作为靶基因的检测假阳性率稍高，而且以SYBR Green I作为荧光染料的特异性较低。肖兴龙等［14］，以ETA作为靶基因设计特异性引物及TaqMan探针，建立Real-time PCR检测绿脓杆菌的方法，由于用到特异性探针，以及ETA的高度保守性，该体系与当时的检测方法相比有着更高的灵敏度和特异性。

相比之下，国外在相关领域的研究则更为成熟，尤其是近几年对于囊肿性纤维化患者临床检测的研究，无论是从靶基因的选取，还是DNA的提取，以及多种方法综合比对分析从而选出最优，都更加系统，并日趋完善。鉴于标准表型鉴定方法费时及其局限性，以及选用16S rDNA、algD、oprI、ETA、gyrB 等靶基因都有一定的假阳性结果出现，Vincent等［15］选用ecfX作为靶基因，检测结果的特异性和阳性预测值均达到100%。oprL基因由于比ETA灵敏，假阳性率低，较适合用于早期囊肿性纤维化患者痰样中绿脓杆菌的检测。Pieter等［16］先是利用oprL基因比较培养法、常规PCR以及Real-time PCR方法检测绿脓杆菌的灵敏度，并优化了DNA提取方案，比较结果显示以探针为基础的Real-time PCR方法可以达到培养法的检测结果，并且检测迅速，能够及时发现早期感染。Pieter等［17］的研究有一部分培养鉴定阴性、Real-time PCR鉴定阳性的样本，在后续观测时间里培养鉴定又转为阳性，这说明以oprL为靶基因的Real-time PCR检测对于绿脓杆菌在预测感染方面有着重要的临床价值。

表1 绿脓杆菌各种检测技术的比较Table 1 Comparison of various detection techniques of Pseudomonas aeruginosa

2.5 基因芯片

基因芯片又称DNA芯片、DNA微阵列，是一种新的基因检测方法，是自上世纪90年代中期以来影响最深远的一项科技进展，是基础研究可靠并有效的工具。其在致病菌检测领域有着前所未有的优势:它具有PCR的高灵敏度与分子杂交的高特异性的双重优势，显著提高了检测的灵敏度和特异性;它能对同一致病菌进行多基因位点检测，避免了单一位点检测的缺陷，大大降低假阳性，显著提高信噪比;它能同时对多种致病菌进行检测，降低单项检测成本;此外，它还自带质控体系，可以检测和消除系统误差。将基因芯片技术应用于绿脓杆菌鉴定方面，将大大提高菌株的阳性检出率，缩短检验时间，具有重要的现实意义。瞿良等［18］采用PCR扩增制备绿脓杆菌的靶基因并进行纯化，对由昆明云大生化科技有限责任公司制做的基因芯片进行杂交、洗脱、扫描检测。结果表明，本研究中的基因芯片灵敏度和特异性都比较高，构建的绿脓杆菌基因芯片与标记的探针杂交效果好。说明基因芯片在绿脓杆菌检测方面可靠性很高。

3 比较与讨论

根据对上述各项技术的介绍可以看出，现有的绿脓杆菌检测技术都各自表现出很多优点，但也分别存在着不足。表1中对上述绿脓杆菌的检测技术进行了比较。

通过本文的简单介绍及表1可以看出，应用VITEK法可减少工作量，提高工作效率，但检测结果仍然易受各种因素的影响;分子生物学技术灵敏度高，检测时间短，突破了传统检测方法的局限性，但自身也存在有待提高之处。如常规PCR虽灵敏度特异性都很高，但结果仍有一定的假阳性检出率;多重PCR引物扩增会有相互干扰的现象;PCR-DHPLC除存在“柱外效应”以外，它的灵敏度还有待进一步的提高。这些不足还需要国内外研究者不断地完善和改进。

此外，分子生物学检测的各项技术绿脓杆菌运用到了不同的靶基因，通过文献介绍发现不同的靶基因中也存在着相应的优点与不足，下面就绿脓杆菌检测所涉及到的各个靶基因进行比较，如表2。比较可以看出，靶基因的选择对于检测结果的特异性和准确性不同，所以在实际工作中，需要根据对检测结果的要求选择不同的检测方法和靶基因。

表2 检测绿脓杆菌所选靶基因的比较Table 2 Comparison of different target genes for detection of Pseudomonas aeruginosa

4 结论与展望

目前国内的绿脓杆菌分子生物学检测技术正在逐步兴起，准确、灵敏、快速的分子生物学检测技术正在显现它巨大的潜力与优势。尤其是实时荧光定量PCR技术，相比其他分子生物学检测技术，检测技术更加成熟，检测结果更加高效。由于SYBR Green Real-time PCR体系的成本低，起初国内研究者构建以SYBR Green为荧光染料的检测体系，虽然与常规PCR相比有着更高的灵敏度和特异性，但作为双链DNA结合染料，SYBR Green法产生的假阳性结果偏高。因此，需要建立特异性更高的TaqMan探针Real-time PCR检测体系。通过国内外研究比对，oprL、ETA、ecfX等均为检测绿脓杆菌所需较为理想的靶基因，可以作为后续建立体系的筛选备用靶基因。此外，多重PCR技术在同时检测多种致病菌方面表现出一定的优越性，若将其与Real-time PCR相结合，不失为高效检测绿脓杆菌以及其他致病菌的另一途径。

当然，各种方法的结果其意义是不同的，传统的病原培养、分离、鉴定与检测技术虽然耗时长、检出敏感性差，但不论在疾病的诊断还是卫生学评价中仍是不可缺少的金标准，也是分子生物学技术所不能取代的。我们要将传统的病原菌培养方法作为基础，与分子生物学技术相结合相并行，才能得出最准确的检测结果，才能实现最终的检测目标。

［1］张伟，李闻，张伟尉，等.基于PCR技术的绿脓杆菌快速检测方法研究［J］.中国卫生检验杂志，2005，15(9):1065-1067.

［2］郑晶，马骋，黄晓蓉，等.食品中绿脓杆菌检测方法的研究［J］.食品科学，2007(7):419-424.

［3］黎昊雁，王玮，施伟良，等.使用VITEK检测化妆品中的绿脓杆菌［J］.中国卫生检验杂志，2005，15(1):100-101.

［4］Luiz VF.PCR identification of Pseudomonas aeruginosa and direct detection in clinical samples from CF patient［J］.J Med Microbiol，1999，48:357-361.

［5］Jiru X，Moore JE，Murphy PG.Early detection of Pseudomonas aeruginosa-comparison of conventional versus molecular(PCR)detection directly from adult patients with cystic fibrosis(CF)［J］.Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials，2004(3):21.

［6］Spilker T，Coenye T，Vandamme P.PCR-based assay for differentiation of Pseudomonas aeruginosa from other Pseudomonas species recovered from cystic fibrosis patients［J］.American Society for Microbiology，2004，42(5):2074-2079.

［7］Bogiel T，Deptula A，Gospodarek E.Evaluation of different methodsfordetection ofMetallo-beta-Lactamases in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates［J］.Polish Journal of Microbiology，2010，59(1):45-48.

［8］Devos D，Lim A，Pirnay JP.Direct detection and identification of Pseudomonas aeruginosa in clinical samples such as skin biopsy specimens and expectorations by multiplex PCR based on two outer membrane lipoprotein genes，oprI and oprL［J］.American Society for Microbiology，1997，35(6):1295-1299.

［9］Jeong ES，Lee KS，Heo SH.Triplex PCR for the simultaneous detection of Pseudomonas aeruginosa，Helicobacter hepaticus，and Salmonella typhimurium［J］.Exp Anim，2011，60(1):65-70.

［10］索标，汪月霞，艾志录.食源性致病菌多重分子生物学检测技术研究进展［J］.微生物学杂志，2010，30(6):71-75.

［11］曹际娟，郑秋月，孙哲平，等.变性高效液相色谱检测乳制品和化妆品中绿脓杆菌的研究［J］.食品科学，2009，30(6):139-142.

［12］徐婷婷.荧光定量 PCR技术应用综述［J］.兽医研究，2010，258:48-49.

［13］薛利军，王永智，任浩，等.16S rDNA用作荧光定量PCR靶基因快速检测铜绿假单胞菌［J］.生物工程学报，2006，22(5):789-794.

［14］肖性龙，张经纬，龚俊，等.ETA基因作为荧光定量PCR靶基因设计TaqMan探针快速检测铜绿假单胞菌的研究［J］.生物工程学报，2008，24(4):581-585.

［15］Cattoir V，Gilibert A，Glaunec JML，et al.Rapid detection of Pseudomonas aeruginosa from positive blood cultures by quantitative PCR［J］.AnnalsofClinicalMicrobiologyand Antimicrobials，2010(9):21.

［16］Deschaght P，Schelstraete P.Comparison of culture and qPCR for the detection of Pseudomonas aeruginosa in not chronically infected cystic fibrosis patients［J］.BMC Microbiology，2010(10):245.

［17］Deschaght P，BaereTD.Comparison of the sensitivity of culture，PCR and quantitative real-time PCR for the detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum of cystic fibrosis patients［J］.BMC Microbiology，2009(9):244.

［18］瞿良，王惠萱，谭德勇，等.铜绿假单胞菌的基因芯片检测研究［J］.国际检验医学杂志，2010，31(11):1201-1202.

［19］Xuan Q，Julia E，Jenny S，et al.Use of real-time PCR with multiple targets to identify Pseudomonas aeruginosa and other nonfermenting gram-negative bacilli from patients with cystic fibrosis［J］ .JournalofClinicalMicrobiology，2003(9):4312-4317.

Research advances in molecular detection of Pseudomonas aeruginosa

ZHANG Xin-yue1，ZHANG Xiu-jun1，*，HE Cong-fen2，GAO Lu2
(1.College of Life Sciences，Hebei United University，Tangshan 063000，China;2.College of science，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China)

TS201.2

A

1002-0306(2012)12-0401-05

2011-06-28 *通讯联系人

张昕悦(1987-)，女，在读硕士研究生，研究方向:病原生物学。