角质细胞生长因子促进大鼠胰腺导管上皮细胞体外增殖

吴 刚，张晓健，白 光

(辽宁医学院附属第一医院肝胆外科，辽宁锦州121000)

胰腺导管上皮细胞(pancreatic ductal epithelial cells，PDECs)可在适宜的条件下增殖分化为胰岛素分泌细胞，是胰岛移植治疗糖尿病(diabetes mellitus，DM)的理想种子细胞。但是，目前还没有一套良好的PDECs培养增殖的实验方案，实现PDECs体外大量增殖成为亟待解决的问题。角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor，KGF)是一种能特异性促进上皮细胞增殖的生长因子［1－5］，对多种器官具有保护作用，并且在损伤修复过程中大量表达，可通过促进有丝分裂、激活信号通路及调节酶活性等方面促进上皮细胞增殖和迁移作用。本实验以大鼠胰腺组织为材料，建立一种良好有效的PDECs培养增殖方法，并探讨不同浓度的KGF在体外对大鼠PDECs增殖的影响，寻找解决胰岛供体短缺的有效途径。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级SD大鼠20只，6～7周龄，雌雄不限，体质量250～300 g，辽宁医学院动物实验中心提供［SYXK(辽)2009-0004］。

1.2 主要试剂

KGF、DTZ、V型胶原酶和 CK19单克隆抗体(Sigma公司);Hank's液、0.25%胰蛋白酶、RPMI-1640培养基、DMEM/F12培养基(1∶1)和FBS(Gibco公司);DMSO、DAB酶底物显色试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)。

1.3 原代PDECs的分离、纯化和培养

所有大鼠术前禁食12 h，禁水4 h。采用逆行胆管灌注胶原酶法获得细胞。采用不连续密度梯度离心法、差速贴壁法纯化细胞。将部分细胞悬液移入非黏附培养瓶中培养，加入无血清的高糖DMEM/F12培养基(50 μg/L霍乱毒素、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、1 g/L ITS);另将部分细胞培养于放置有盖玻片的培养皿中，行细胞鉴定。

1.4 免疫细胞化学染色法鉴定细胞表面标志物

收集6孔板中的盖玻片(盖……