二氯化钴致人结肠癌细胞系CacyBP/SIP核转位

谢福利，仇长青，赵盈盈，杨 博，冯珊珊，翟惠虹*

(1.宁夏师范学院医学院，宁夏固原756000;2.宁夏医科大学临床学院总医院消化内科，宁夏银川750004)

低氧在结肠癌发生过程中具有重要的作用［1］，可促进结肠癌细胞增殖、抑制凋亡及增强化疗耐药［2］，但具体机制不清。CacyBP/SIP自1996年发现以来，越来越多的证据显示［3］:在肿瘤发生、发展、侵袭及转移等方面都有重要的作用;同时，具有依赖Ca2+浓度的核转位现象［4］，核转位后促进结肠癌细胞增殖［5］。低氧是否可诱导CacyBP/SIP核转位?本研究拟通过构建CacyBP/SIP过表达慢病毒颗粒，转染至结肠癌细胞，给予 CoCl2刺激，观察CacyBP/SIP在结肠癌细胞中的定位。

1 材料与方法

1.1 材料

结肠癌细胞SW480(上海中科院);CoCl2(Sigma公司);胞质胞核蛋白抽提试剂盒(Pierce公司);CacyBP/SIP mAb(Cell signaling公司);293T细胞、pGC-LV重组载体、pHelper 1.0和pHelper 2.0(吉凯基因公司);其他相关试剂(Fermentas、SinoBio、Takara、NEB、捷瑞公司)。

1.2 方法

1.2.1 过表达CacyBP/SIP慢病毒载体构建:应用人结肠癌细胞系HCT-116的cDNA序列，采用Primer Premier v5.0软件设计上游和下游引物，用PCR法扩增CacyBP/SIPcDNA序列。带有绿色荧光的慢病毒载体与目的基因分别用NheⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，T4连接酶将酶切后的产物相连，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，应用PCR法筛选阳性克隆，接种阳性转化子，送测序。用 Lipofectamine2000共转染pGC-LV载体和两种辅助包装原件载体至293T细胞包装。培养8h更换为完全培养基，培养48 h后，收集上清液，浓缩后在293T细胞中采用逐孔稀释法测定并标定病毒滴度。

1.2.2 转染结肠癌细胞:常规培养传代，在T50瓶细胞长至30% ～50%时，每瓶加入500 μL(5 mg/L)Polybrene、4 400 μL完全培养基和100 μL(1 ×108个细胞)过表达CacyBP/SIP的慢病毒颗粒，放入培养箱培养8～12 h弃去细胞上清，更换为新鲜培养基继续培养。……