HMGB1调控区Jurkat稳定细胞株的构建①

张晨光 王辉 牛志国 时慧森 尹明梅 王雪平 胡亚会 郑融融 孔海瑞 陈 仪 胡丽华(华中科技大学同济医学院附属协和医院检验科，武汉430022)

HMGB1调控区Jurkat稳定细胞株的构建①

张晨光 王辉②牛志国②时慧森③尹明梅③王雪平③胡亚会③郑融融③孔海瑞③陈 仪③胡丽华(华中科技大学同济医学院附属协和医院检验科，武汉430022)

目的:构建不同长度的高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因调控序列的真核表达载体及其稳定表达的Jurkat细胞株，为研究HMGB1基因在白血病发病机制建立基础。方法:以Jurkat细胞基因组为模板，PCR扩增3'端固定的8个不同长度的HMGB1调控基因(－83 bp～+83 bp、－383 bp～+83 bp、－504 bp～+83 bp、－688 bp～+83 bp、－975 bp～+83 bp、－1 163 bp～+83 bp、－1 327 bp～+83 bp、－1 520 bp～+83 bp)，均将其连入pMD18-T载体，并转化大肠杆菌DH5a。对氨苄青霉素筛选的阳性克隆进行扩增、质粒抽提，应用KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ双酶切鉴定和DNA测序获得序列正确的阳性克隆，然后再经酶切连入pGL3-neo-luc质粒，成功构建HMGB1基因调控序列报告基因pGL3-HMGB1-luc(按由短至长顺序依次命名为1～8号质粒)。利用脂质体介导的方法将不同长度的pGL3-HMGB1-luc质粒和pGL3-neo-luc质粒分别转染至Jurkat细胞，48小时后加入终浓度600 μg/ml的G418进行药物加压筛选，20天后得到有效转染pGL3-HMGB1-luc及pGL3-neo-luc载体的Jurkat细胞株(按有无HMGB1调控基因及其由短至长顺序，依次命名为NEO细胞和1～8号细胞)。通过检测荧光素酶活性，验证构建的Jurkat稳定细胞株(Jurkat-HMGB1)。结果HMGB1调控基因成功插入到pGL3-neo-luc的XhoⅠ和HindⅢ位点之间构建出3号质粒;HMGB1调控序列1016 bp定向克隆至3号质粒的KpnⅠ和XhoⅠ位点之间，成功构建出8号质粒;将166、466、771、1 058、1 246、1 410 bp长度的HMGB1调控基因定向克隆至3号质粒的KpnⅠ和HindⅢ位点之间，分别构建出1号、2号、4号、5号、6号、7号质粒。8个质粒均经KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ双酶切，电泳显示条带与扩增的HMGB1调控序列长度一致。……