5－氮杂胞苷对大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化的研究

孙思 杜小文 徐剑炜a

（1.复旦大学附属中山医院急诊科，a整形外科，上海 200032；2.浙江省金华市人民医院泌尿外科，浙江 金华 321001）

骨髓基质中的多能细胞能够分化成为多种中胚层来源的间质细胞，故被称为骨髓间充质干细胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）。这些细胞在一定条件下可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌样细胞，而且经过20～30个培养周期，仍能保持多向分化的潜能[1－2]。

本试验采用密度梯度离心和贴壁分离相结合的方法分离培养大鼠BMSCs，用形态学观察和流式细胞仪鉴定其表面抗原特性；用5－氮杂胞苷（5-azacy tidine，Sigma）在体外作用于大鼠BMSCs，诱导其向肌样细胞分化，最后通过免疫组化染色来鉴定这些细胞的蛋白表达；旨在探讨体外诱导BMSCs向横纹肌肌细胞分化的可行性，为干细胞在组织工程学的应用提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 标本采集 选用1周龄SD大鼠，处死后置于75%乙醇中浸泡10 min。无菌条件下分离大鼠的四肢长骨，用1 mL注射器抽吸培养液（Dulbecco＇s modified Eagle＇s medium，DEME，Sigma），从骨髓腔内冲出骨髓，将骨髓液注入Percoll细胞分离液试管中，890 g／min离心，取中间的单个核细胞悬浮层，再加入培养液2 mL制成单细胞悬液，再离心后弃去上清液，加入2 mL培养液吹打制成细胞悬液。台盼蓝细胞计数后将单细胞悬液以1×105／mL的密度接种于直径10 cm的无菌培养皿内（培养基含10%优质胎牛血清），置于5%CO2、37℃条件下培养。

1.2 细胞培养 接种后第2天更换培养基，去掉非贴壁细胞，以后每3 d换液1次。待5～10 d细胞生长融合达90%时，用0.25%的胰蛋白酶加2 g／L乙二胺四乙酸（EDTA）3 mL，消化细胞。然后将细胞以1∶3接种于直径10 cm培养皿培养，加入10 mL培养液，于37℃恒温、5%CO2环境中培养。

1.3 表型鉴定 取传至P3代后的细胞，通过流式细胞仪检测荧光异硫氰酸盐（fluoresceine isothiocyanate，FITC）荧光标记的 CD29、CD34、CD45、CD105细胞表面抗原。

1.4 诱导分化 将已长满的P2代BMSCs用EDTA消化后，按1∶3重新接种于含10%优质胎牛血清培养基的24孔板内，接种3 d后换液，在新培养液中加入5－氮杂胞苷10μmol／L，作用24 h。24 h后弃去含5-氮杂胞苷的培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤2次，改用含5%优质胎牛血清的培养基继续培养，每3 d换液1次。

1.5 免疫组化 1周及3周时分别取接种于24孔板内的诱导细胞进行免疫组织化学苏木精－伊红（hematoxylin-eosin，HE）、结蛋白、α－横纹肌动蛋白（α-sacromeric actin，α-SMA）染色，与未经诱导的BMSCs比较，并在显微镜下观察细胞形态及染色变化。

2 结 果

2.1 BMSCs细胞形态及生长情况 本实验选用1周龄SD大鼠，此年龄大鼠四肢长骨中骨髓丰富，BMSCs含量高，1只胎鼠的四肢长骨骨髓原液可分离得到1×106～2×106个细胞，培养2 d后贴壁率约60%。细胞增殖迅速，5 d后即出现融合现象，培养5～10 d后，细胞生长融合达90%，细胞形态发生较大变化，可见纺锤形和星形多突起样生长，P0代第10天细胞的生长形态见图1。此时可以进行传代扩增，经蛋白酶消化后呈单个圆形细胞。长满直径10 cm培养皿后可得细胞量3×106～5×106个。传到P5代后细胞仍然形态良好，生长速度未见明显减慢，细胞的生长曲线见图2。

2.2 流式细胞仪表型鉴定 流式细胞仪检测结果显示，分离培养的细胞表面抗原CD29阳性率89.4%，CD105阳性率46.0%，CD34阳性率3.3%，CD45阳性率2.5%（阳性率由仪器自动判断显示，图3）。

图3 流式细胞仪检测结果

2.3 5-氮杂胞苷诱导分化后的细胞 5-氮杂胞苷诱导后继续培养3周，部分细胞变为多角形，呈长梭形生长，胞膜清楚，无空泡，胞内可见趋于融合的多核肌管样细胞结构，见图4。

2.4 蛋白表达 未经5－氮杂胞苷诱导的P3代BMSCs在培养15d时，结蛋白和α－SMA两种蛋白几乎不着色，见图5-1；诱导后1周的细胞质内有2种蛋白染色，细胞核染深色，细胞质内结蛋白染色为淡蓝色，α-SMA染色为褐色，见图5-2；诱导后3周的细胞2种蛋白染色较1周时明显增强，见图5－3。

图4 诱导后3周肌样细胞形态（×10）

图5 免疫组化结果（×40）

3 讨 论

BMSCs细胞体积小、核大、胞浆少，细胞器不发达，从骨髓提取时需注意与骨髓基质细胞（marrowderived stromal cells，MDSCs）的区分。BMSCs和MDSCs都起源于中胚层。MDSCs属于骨髓造血系统细胞，有分化为造血细胞的潜能，但在自然情况下它无分化为造血细胞倾向。BMSCs并不表达造血细胞表面抗原，如前体细胞标记抗原CD34、成熟造血细胞标记抗原CD38、白细胞标记抗原CD45、淋巴细胞表面抗原CD11a和单核巨噬细胞表面抗原CD14，而只表达 CD29、CD44、CD105、CD166等基质细胞和间质细胞的特异性表面标记，尤其是CD105和CD166被作为BMSCs的特征性标志。本实验分离得到的细胞CD29阳性率达89%，CD105阳性率达46%，而CD34阳性率只有3.3%，CD45阳性率2.5%，与相关文献相近[3－4]，说明本研究获取的细胞为纯度较高的大鼠BMSCs。本实验获得的BMSCs表面的CD29和CD105阳性率有差异，可能来源于抗体孵育和测量时造成的部分失活而引起的实验误差，这是在合理范围内的。

5－氮杂胞苷是一种去甲基化药物，推测其可能与调控肌样细胞分化的特异启动子基因上的阻截蛋白结合，使DNA的胞嘧啶去甲基化，最终激活启动肌细胞定向分化的调控基因，诱导BMSCs向肌样细胞分化。有实验研究表明，BMSCs的诱导分化程度与5－氮杂胞苷浓度和作用时间有关，在10μmol／L作用24 h诱导作用最强[5]。5-氮杂胞苷浓度低、作用时间短时，诱导分化不明显；浓度超过20 μmol／L和作用时间超过48 h，则可引起细胞死亡脱落。

本研究结果表明，未经诱导的P3代BMSCs不表达结蛋白和α-SMA。经5－氮杂胞苷诱导后培养的BMSCs分别进行结蛋白和α-SMA免疫组织化学染色，1周时为弱阳性，3周时为阳性，表达逐渐增强，表明经过诱导后的细胞已向肌样细胞分化。TGF-β也能诱导BMSCs向肌细胞分化[6]。有研究认为，5－氮杂胞苷诱导间充质干细胞分化为心肌样细胞的作用较强，而向平滑肌细胞的诱导作用较弱[7]。本实验诱导得到的肌样细胞表达的结蛋白和α-SMA在骨骼肌和平滑肌中也都有表达，所以较难将其定性。经5-氮杂胞苷诱导后的BMSCs明显表达肌样特异性蛋白，说明干细胞具有定性分化能力，这种前体肌细胞经外界环境再刺激后，可能分化出3种不同的肌细胞。

[1]Pittenger MF，Mackay AM，Jaiswal SC，et al.Multilineage portential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science，1999，284（5411）：143-147.

[2]Satomura K，Derubeis AR，Fedarko NS，et al.Receptor tyrosine kinase expression in human bone marrow stromal cells[J].J cell Physiol，1998，177（3）：426-438.

[3]Karaöz E，Dogˇan BN，Aksoy A，et al.Isolation and in vitro characterisation of dental pulp stem cells from natal teeth[J].Histochem Cell Biol，2010，133（1）：95-112.

[4]Sun S，Guo Z，Xiao X，et al.Isolation of mouse marrow mesenchymal progenitors by a novel and reliable method[J].Stem Cells，2003，21（5）：527-535.

[5]Xing Y，Lv A，Wang L，et al.Engineered myocardial tissues constructed in vivo using cardiomyocyte-like cells derived from bone marrow mesenchymal stem cells in rats[J].J Biomed Sci，2012，19（1）：6-17.

[6]Ninomiya K，Takahashi A，Fujioka Y，et al.Transforming growth factor-beta signaling enhances transdifferentiation of macrophages into smooth muscle-like cells[J].Hypertens Res，2006，29（4）：269-276.

[7]Yoon BS，Yoo SJ，Lee JE，et al.Enhanced differentiation of human embryonic stem cells into cardiomyocytes by combining hanging drop culture and5-azacytidine treatment[J].Differentiation，2006，74（4）：149-159.