褪黑素对脊髓损伤早期大鼠神经生长因子表达的影响

徐玉生，马玉斐，李星晨，曾冠楠

郑州大学第一附属医院骨科 郑州 450052

脊髓原发机械损伤后会引起一系列级联式的病理变化，主要包括局部微循环障碍、氧化应激[1]、中性粒细胞浸润[2]、细胞坏死和凋亡[3]等，而脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)往往又是全身多发创伤的一部分，患者病情常常复杂而严重。目前治疗SCI疗效确切的药物并不多，其中最常用的是甲基强的松龙(methylprednisolone，MP)，但应用 NASCIS 24 h给药方案可引起继发于MP的急性内固醇性肌病[4]，大剂量MP还可能引发肺部及胃肠道并发症，易导致高龄者呼吸系统并发症及感染[5]。褪黑素(melatonin，MT)是由松果体产生的一种作用广泛且功能强大的吲哚类激素，具备抗肿瘤、调节生物体昼夜节律、抗氧化及清除自由基、镇痛及免疫调节[6-7]等作用，对SCI有较强的治疗作用，但对其机制的研究大多局限于抗氧化及清除自由基方面。作者通过观察MT对SCI大鼠血清神经生长因子(nerve growth factor，NGF)水平、脊髓组织内NGF mRNA和蛋白表达水平的影响，探讨MT治疗SCI的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 ①实验动物:SPF级健康成年雄性SD大鼠60只，体质量(350±30)g，购自河南省实验动物中心，许可证号:SCXK(豫)2010-0002。②主要试剂及仪器:Trizol试剂、EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒、EasyTaq DNA Polymerase试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司;大鼠NGF检测试剂盒购自美国RD公司;兔抗鼠NGF抗体、DAB试剂盒、SP9002免疫组化试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司;MDA测定试剂盒、总SOD测定试剂盒均购自南京建成科技有限公司;MT购自美国Sigma公司。PCR GeneAmp System(美国Applied Biosystems公司);D-140图像记录分析系统(大连Jim-X Scientific公司)。

1.2 动物模型的建立 大鼠以水合氯醛腹腔注射麻醉，俯卧位固定于手术台上。术区备皮，常规消毒，取后正中切口，以T12为中心显露T11～T13棘突和椎板，咬除该节段椎板，暴露脊髓硬膜。先于硬膜上方放置一块矩形的塑料垫片(0.4 mm×0.3 mm)，再采用改良的Allen’s WD法，用5 g的重锤自距硬膜10 cm的高处沿导管垂直落下，造成大鼠SCI模型。造模成功的标准:打击后鼠尾出现无规则的痉挛性摆动、双下肢呈回缩性扑动，硬膜表面充血水肿。术毕以生理盐水冲洗术野，再次消毒后常规缝合。

1.3 实验分组 按随机数字表法将大鼠分为3组，每组20只。模型组和MT组按上述方法造模后10 min分别腹腔注射等体积的无水乙醇及MT(100 mg/kg)，假手术组仅行椎板切除术不损伤脊髓。3组大鼠均给予青霉素40万U肌内注射，并于术后4、8 h人工辅助排尿2次。观察并记录3组大鼠的一般情况。

1.4 观测指标

1.4.1 Basso Beattie Bresnahan(BBB)运动功能评分术后12 h将大鼠置于实验台上，待其适应环境后由2位熟悉评分标准但不知分组者独立观察10 min，进行BBB运动功能评分，取平均值作为评分结果。

1.4.2 脊髓组织中NGF mRNA的检测 BBB运动功能评定完成后，每组大鼠均取12只，断头取血，并以损伤处为中心取约1 cm长的脊髓，生理盐水冲洗干净后－80℃条件下保存。取冻存的脊髓标本100 mg，研碎后以Trizol法提取总 RNA，逆转录得 cDNA，取2 μL按试剂盒说明书配制反应体系，以GAPDH为内参，进行PCR扩增。NGF引物序列:正义链为 5’-AATCAACTCCTGCTTGGC-3’，反义链为5’-GTATTTAGCCCCTCCTCC-3’，扩增长度 349 bp。GAPDH引物序列:正义链为 5’-CAGTGCCAGC CTCGTCTCAT-3’，反义链为 5’-AGGGGCCATCCA CAGTCTTC-3’，扩增长度595 bp。PCR反应条件:94℃预变性2 min;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30个循环;72℃总延伸6 min。取5 μL产物进行琼脂糖凝胶电泳，EB染色，在紫外线投射仪下观察电泳条带，用D-140图像记录分析系统进行分析，以NGF与GAPDH条带灰度值的比值表示NGF mRNA的相对表达量。

1.4.3 血清NGF水平检测 血液室温静置30 min自然凝固，3000 r/min离心20 min后收集血清，－20℃条件下保存。采用ELISA法检测NGF，按试剂盒说明操作，最终于450 nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线，计算NGF水平。

1.4.4 脊髓标本病理观察和NGF蛋白检测 另8只大鼠剖胸后经左心室-主动脉插管，多聚甲醛灌流固定，以损伤处为中心取出约1 cm长的脊髓，常规制片，5 μm厚连续切片，HE染色，观察脊髓病理改变。每只大鼠取同序数切片3张，按SP9002试剂盒说明书操作进行NGF蛋白检测，以PBS代替一抗作为阴性对照。胞核和(或)胞质黄褐色或黑色着色为阳性细胞。每张片计数高表达区3个高倍视野中的阳性细胞数，取算术平均数代表该标本NGF蛋白的表达水平。

1.5 统计学处理 实验数据采用SPSS 17.0进行分析，3组BBB评分、血清NGF水平、脊髓组织中NGF mRNA及蛋白表达水平的比较采用单因素方差分析，方差齐时，组间两两比较采用LSD-t检验，方差不齐时采用Tamhane’s T2检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3组大鼠术后一般情况观察 模型组大鼠术后精神萎靡，进食量较术前明显减少，饮水增多。MT组和假手术组大鼠术后精神状况明显好于模型组，进食量较术前无明显变化，但饮水均增多。模型组和MT组大鼠术后均出现不同程度的尿潴留情况，均需人工辅助排尿;均出现明显的后肢运动功能障碍，表现为双侧后肢无法支撑身体，尾巴持续下垂或翘起无力，活动时前后肢动作不协调，总是由前肢拖动身体移动等。假手术组基本无运动功能障碍。3组BBB评分结果见表1。由表1可知，与假手术组比较，模型组和MT组的BBB评分明显降低，但模型组与MT组比较差异无统计学意义。

2.2 3组大鼠脊髓标本病理表现 模型组和MT组均可见脊髓组织内片状出血、结构紊乱及神经细胞水肿等变化，但MT组上述病理变化较模型组轻;假手术组脊髓结构清晰，无出血、神经细胞水肿等，见图1。

2.3 3组大鼠血清NGF水平及脊髓组织中NGF mRNA和蛋白检测结果 见图2、3和表1。NGF蛋白阳性细胞主要集中于脊髓前角和其周围的灰质中，多聚集成团。由表1可知，与假手术组比较，模型组和MT组血清NGF水平、脊髓组织NGF蛋白和mRNA表达水平均明显升高，MT组较模型组升高更明显。

图2 3组大鼠脊髓组织中NGF mRNA的表达

图3 3组大鼠脊髓前角组织中NGF蛋白的表达(SP，×400)

表1 3组BBB评分、血清NGF水平及脊髓组织NGF mRNA和蛋白的表达

3 讨论

虽然大量的研究已经证实MT对于SCI具有较强的治疗作用，但大多是围绕其抗氧化、抑制炎症反应、减少神经细胞凋亡[3，6-8]等机制去解释的，而该研究则主要关注其对SCI大鼠体内NGF表达水平是否有影响。NGF是1951年发现的首个典型的神经营养因子，它对多种神经细胞的发育、存活和功能的维持具有重要作用。SCI后大鼠体内NGF的表达会保护性升高，这种生理反应有利于支持受损神经细胞的存活和修复[9]。但 SCI后局部微环境中NGF水平不能维持持续有效是预后不佳的重要原因之一[10-11]。NGF属于多肽蛋白质，难以透过血脑屏障，且其生物半衰期短，需长期反复给药才能维持有效的浓度，使得其临床应用受到了很大限制[12]。

作者观察到SCI模型组和MT组大鼠体内NGF水平较假手术组升高，而MT组大鼠体内NGF水平较模型组升高更明显，且其脊髓的病理变化较模型组减轻，提示MT可以通过提高体内NGF的表达，促进SCI的修复。MT凭借其高度脂溶性的分子结构，可轻易地穿过血脑屏障并于数分钟内在神经组织中浓集[13]，同时具有较高的安全性，在生理和治疗剂量下均无明显的副作用[14]，使得MT治疗SCI更具优势。实验中MT虽可显著改善损伤后脊髓的病理变化，但并未改善损伤后早期(12 h内)大鼠的运动功能障碍，可能是由于该治疗剂量的MT还不具备此效力，或是此时还处于脊髓休克早期，其治疗作用还未完全表现出来。作者将进一步观察应用MT后更长时间段内大鼠体内NGF水平的变化规律及神经功能恢复情况，对MT治疗SCI的机制进行深入探讨。

作者还观察到MT组大鼠术后在精神状态和食欲方面明显好于模型组。MT可维持生物正常的昼夜节律，减少由SCI引起的节律紊乱而造成的疲劳、焦虑和抑郁[15];同时MT有明显的镇痛作用[16]。这些作用也有利于损伤的恢复。

总之，作者认为，MT可通过抗氧化、调节NGF的表达及改善节律紊乱等，在SCI治疗方面发挥有效作用，这为临床应用MT治疗SCI提供了理论依据。

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